Здесь мы описываем метод индуцирования менингококкового менингита через инбактериальный маршрут инфекции у взрослых мышей. Мы представляем шаг за шагом протокол менингококковой инфекции от подготовки инокулума к инрасистской инфекции; затем записать выживаемость животных и оценить бактериальные нагрузки в мурин тканях.
Neisseria meningitidis (менингококк) является микроорганизмом узкого диапазона, всемирно признанным в качестве ведущей причины бактериального менингита. Менингококк является преходящим колонизатором носоглотки человека примерно 10% здорового субъекта. В особых обстоятельствах он приобретает инвазивную способность проникать через слизистый барьер и вторгается в кровоток, вызывая септицемию. В последнем случае, фумиминиз может возникнуть даже без последующего развития менингита. И наоборот, бактерии могут плохо размножаться в кровоток, пересекать гематоэнцефалический барьер, достигать центральной нервной системы, что приводит к фуминантному менингиту. Морин модели бактериального менингита представляют собой полезный инструмент для изучения взаимодействия хозяина-патогена и анализа патогенетических механизмов, ответственных за это смертельное заболевание. Хотя за последние десятилетия было оценено несколько экспериментальных модельных систем, ни одна из них не смогла воспроизвести характерные патологические явления менингококковой инфекции. В этом экспериментальном протоколе мы описываем детальную процедуру индукции менингококкового менингита в мышиной модели, основанной на инрасистальной прививке бактерий. Специфические признаки человеческого менингита были зафиксированы в муринском хозяине путем оценки клинических параметров (например, температуры, массы тела), оценки выживаемости, микробиологического анализа и гистологического исследования черепно-мозговой травмы. При использовании intracisternal (i.cist.) инокулум, менингококки полной доставки непосредственно в цистерну magna, что приводит к очень эффективной менингококковой репликации в ткани мозга. 1000-кратное увеличение жизнеспособного количества бактерий наблюдается примерно в 18 ч. Кроме того, менингококки также находятся в селезенке и печени инфицированных мышей, предполагая, что печень может представлять собой целевой орган для менингококковой репликации.
Neisseria meningitidis является Грам отрицательным -proteobacterium ограничивается человеческого хозяина, хорошо известный как одна из наиболее распространенных причин менингита и сепсиса в человеческой популяции во всем мире. Он колонизирует верхние дыхательные пути (нос и горло) здоровых и бессимптомных носителей (2-30% населения), но бактерия иногда уклоняется от различных иммунной защиты хозяина и распространяется из кровотока в мозг, вызывая неконтролируемый местный воспаление, известное как менингококковый менингит. Сочетание хоста и бактериальных факторов, как представляется, способствуют переходу от commensal к инвазивному поведению1.
N. meningitidis специализируется исключительно на колонизации человека и инфекции. Он имеет узкий диапазон хоста и, следовательно, имеет ограниченный в виво патогенеза исследований из-за отсутствия подходящих моделей животных, которые воспроизводят человека менингококковой инфекции. В результате этого возникли фундаментальные пробелы в понимании патогенеза септицемии и менингита, вызванного менингококком. В последние десятилетия, развитие многих систем in vitro позволило выявить несколько менингококковых факторов вирулентности2,3,4. Хотя эти ценные исследования дали важные идеи, чтобы понять роль этих факторов для успешной менингококковой инфекции, эти модели не позволили оценить последствия бактериальных взаимодействий с юмористической и клеточной иммунной системы и тем более со всей тканью. In vivo животных моделей инфекции имеют большое значение, а также для оценки степени защиты присуждается вакцины составы. Как человек-тропический патоген, менингококк обладает соответствующими детерминантами, необходимыми для успешной инфекции, такие как поверхностные структуры (т.е. iv тип pili и непрозрачные белки) и системы поглощения железа для человеческих рецепторов и транспортных белков (т.е., трансферрин и лактоферрин)5,6, 7правильно придерживаться, выжить и вторгнуться в человека хозяина. Наконец, генетические способности вариации патогена, чтобы избежать и / или блокировать иммунный ответ человека далее способствовать высоким видов тропизма8,9. Поэтому отсутствие конкретных факторов, участвующих во взаимодействии, может блокировать этапы жизненного цикла возбудителя, создавая значительные трудности в развитии моделей мелких животных, суммирующих менингококковый жизненный цикл.
За последние десятилетия было разработано несколько подходов для улучшения нашего понимания менингококкового инфекционного цикла. Инфекции двух животных модели, мыши и крысы, либо интраперитонеально (т.п.) или интраназалически (т.н.), были разработаны для воспроизведения менингококковой инфекции10,11,12,13,14 ,15,16,17. Лабораторная мышь, вероятно, является одним из наиболее универсальных животных для индуцирования экспериментальной менингококковой инфекции.
Тем не менее, i.p. способ инфекции приводит к развитию тяжелого сепсиса, хотя он не имитирует естественный маршрут инфекции, в то время как i.n. маршрут инфекции был полезен для оценки менингококкового патогенеза, хотя это может вызвать легочную инфекцию до сепсиса10,11,12,13,14,15,16,17.
Модель мыши i.p. сыграла важную роль для оценки защиты от менингококковой задачи10,11,12. Мышь модель менингококковой колонизации на основе i.n. маршрут инфекции была разработана с младенцем мышей, так как они более восприимчивы к менингококки, чтобы воспроизвести инвазивную инфекцию, имитирующую ход менингококковой инфекции у людей 13,14,15,16,17. Кроме того, для содействия менингококковой репликации в мурин хост, все большее число технических стратегий были также применены в том числе введение железа для животных для улучшения инфекции, использование высокобактериального инокулума, мышь проходимых бактериальногоштамма,а также занятости младенцев или иммунокомпромиссных животных хостов10,13,15,18,19. Выражение специфических человеческих факторов, таких как CD4620 или трансферрин21, повысило восприимчивость мышей к этой антропо-тропической бактерии; занятости кожи человека ксенотрансплантат амодель инфекции также было полезно для оценки способности сагения менингококков к человеческому эндотелию22,23. В совокупности недавнее развитие гуманизированных трансгенных мышей улучшило понимание менингококкового патогенеза и его взаимодействий с хозяином.
Ранее мы разработали модель менингококкового менингита, где прививка бактерий была выполнена в цистерну magna взрослых мышей с мышью проходных бактерий24. Клинические параметры и выживаемость инфицированных мышей продемонстрировали установление менингита с характеристиками, сравнимыми с характеристиками, наблюдаемыми у хозяина человека, а также микробиологическим и гистологическим анализом мозга. Из этих инфицированных мышей, бактерии были, также, извлечены из крови, печени и селезенки, и бактериальные нагрузки из периферических органов коррелирует с инфекционной дозы. В частности, эта модель была использована для оценки вирулентности изогенного штамма мутантов, дефектных в L-глютамате транспортер GltT24. Недавно, используя нашу мышь модель менингококкового менингита на основе i.cist. маршрут с штаммом серогруппы С 93/42862,24 и изогенным мутантом, дефектным в гене csSA, кодирующем для UDP-N-ацетилглукосазамин 2-эпимемараза25, мы проанализировали роль подвергаются сиалевой кислоты в учреждении болезней у мышей.
В этом протоколе мы описываем простой метод индуцирования экспериментального менингококкового менингита на основе i.cist. маршрут инфекции у взрослых мышей Balb/c. Этот метод особенно полезен для характеристики менингококковой инфекции у муринхообразного хозяина, а также для оценки вирулентности между штаммами дикого типа и изогенными мутантами. Внутрицистеральный маршрут инфекции обеспечивает полную доставку менингококков непосредственно в цистерну магна, которая, в свою очередь, облегчает бактериальную репликацию в спинномозговой жидкости (CSF) и индуцирует менингит с функциями, которые имитируют те присутствует у людей2,24,25,26.
В этом исследовании мы описываем экспериментальный протокол, чтобы вызвать менингококковый менингит у взрослых мышей i.cist. прививка менингококковых бактерий. Насколько нам известно, никакая другая модель менингококкового менингита не была разработана у лабораторных мышей, инфициров?…
The authors have nothing to disclose.
Исследования были частично поддержаны PRIN 2012 «Грант номер 2012WJSX8K»: «Модели взаимодействия хозяина-микроба при слизистых инфекциях: разработка новых терапевтических стратегий» и PRIN 2017 (2017SFBFER): «Интегрированный подход к взаимодействию между адаптация, стрессовые условия и устойчивость к противомикробным препаратам сложных патогенов».
1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
GC agar base | OXOID | CM0367 | |
Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
Ketamine | Intervet | ||
Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
Xylazine | Intervet |