파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 섬유아세포 성장 인자 수용체2를 표적으로 하는 소형 펩타이드의 스크리닝 및 식별
Summary
본 명세서에서, 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 사용하여 FGFR2에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 시험관내에서 FGFR2를 향한 선택된 펩티드의 친화도 및 세포 증식을 억제하는 능력을 추가로 분석한다.
Abstract
인간 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 패밀리는 세포 증식, 생존, 이동 및 분화를 포함한 다양한 생물학적 활동에 관여하는 4개의 멤버, 즉 FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4를 포함한다. 돌연변이 또는 유전자 증폭 사건으로 인해 FGFR 신호 통로에 있는 몇몇 수차는, 암의 각종 모형에서 확인되었습니다. 따라서, 최근 연구는 FGFRs의 치료 표적화와 관련된 전략 개발에 초점을 맞추고있다. 단클론 항체, 파이프 라인에 몇 펩티드 기반 억제제. 여기서, 우리는 FGFR2의 길항제로 작은 펩티드를 스크리밍하는 파지 디스플레이 기술을 이용한 프로토콜을 제공한다. 간략하게, 파지-디스플레이 펩티드라이브러리를 FGFR2로 코팅된 플레이트에 배양하였다. 이어서, 언바운드 파지를 TBST(TBS + 0.1% [v/v] 트웬-20)에 의해 세척하고, 결합된 파지를 0.2 M 글리신-HCl 완충액(pH 2.2)으로 용출하였다. 용출된 파지는 더욱 증폭되었고 다음 바이오패닝 라운드에 대한 입력으로서 사용되었다. 바이오패닝의 3라운드에 이어, 개별 파지 클론의 펩티드 서열은 DNA 염기서열 분석으로 확인되었다. 마지막으로, 스크리마한 펩티드를 합성하고 친화성 및 생물학적 활성을 분석하였다.
Introduction
섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFRs)는 생체 내 세포 증식, 상처 치유 및 혈관신생에 중요한 역할을한다. 다양한 종양에서 관찰되는 FGFR 신호의 비정상적인 활성화2,3,4,5는 유전자 증폭, 유전자 돌연변이, 염색체 수차 및 과도한 리간드 분비를 포함한다6 . FGFRs를 표적으로 하는 많은 억제제는 임상 시험에서 유망한 치료 효과를 보여주었으며 주로 세 가지 유형으로 분류됩니다: (1) FGFR의 세포내 도메인에 결합하는 소분자 키나아제 억제제, (2) 길항제를 표적으로 하는 길항제 세포 외 세그먼트, 및 (3) FGF 리간드 트랩6. 몇몇 소분자 키나아제 억제제는 시험관내 및 생체내 모두 좋은 치료 효과를 가지고 있지만7,그들 대부분은 표적 특이성이 좋지 않으며 고혈압8과같은 부작용을 나타낸다. 길항제의 대다수는 단일클론 항체9,10 및 폴리펩티드11이다. 펩티드는 특이성과 낮은 부작용으로 인해 작은 분자에 비해 장점이 있습니다. 그(것)들은 또한 세포 투과성을 유지하고 단백질 약12에비교된 특정 기관에 축적되지 않습니다. 따라서, 표적된 작은 펩티드는 모두 효과적이고 장래치료제이다.
파지 디스플레이 기술은 주어진 분자13,14,15에결합 할 수있는 작은 펩티드를 식별하기위한 쉽고 강력한 도구입니다. 표적 분자에 결합하기 위해 꼬리에 표시된 10개 이상의9개 상이한 펩타이드 서열을 가진 간단한 M13 파지를 기반으로 하는 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하였다(재료표 참조)16. 주어진 분자를 향한 파지의 높은 친화도 로 인해, 언바운드 파지는 멀리 세척 될 수 있으며, 원하는 짧은 펩티드와 단단히 결합 된 파지만 유지됩니다. 주어진 분자 표적은 단백질17,18,탄수화물, 배양 세포, 또는 무기 물질19,20을고정화시킬 수 있다. 파지 디스플레이기술(21)을이용하여 생체 내에서 장기 특이적 펩타이드가 선택된 곳에서 흥미로운 사례가 보고되었다. 파지 디스플레이 기술의 장점은 높은 처리량, 작동 용이성, 저렴한 비용 및 광범위한 응용 분야22를포함한다.
본 연구에서, 우리는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 고정화 단백질(FGFR2)에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 기술의 효능은 또한 등소말 적정 열량계(ITC)에 의해 FGFR2를 향하여 얻어진 펩티드의 친화도 및 세포 증식 분석에 의한 생물학적 활성을 측정함으로써 조사된다. 상기 방법은 탄수화물, 배양세포, 또는 무기물질에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하기 위해 확장될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조합 파지 라이브러리는 표적 분자를 결합하고 그들의 기능을 조절할 수 있는 새로운 펩티드의 높은 처리량 스크리닝을 위한 강력하고 효과적인 공구입니다13. 현재 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리는 광범위한 응용 을 가지고 있다. 예를 들어, 수용체단백질(23)및 비단백질 표적24,25,질병 특이적 항원 모방<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 광저우의 과학 기술 프로그램 (No. 2016201604030039)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology – Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
