Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago
Summary
En este documento, presentamos un protocolo detallado para la detección de pequeños péptidos que se unen a FGFR2 utilizando una biblioteca de péptidos de visualización de fagos. Analizamos más a fondo la afinidad de los péptidos seleccionados hacia FGFR2 in vitro y su capacidad para suprimir la proliferación celular.
Abstract
La familia humana Detensíto de Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGFR) está compuesta por cuatro miembros, a saber, FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4, que participan en diversas actividades biológicas, incluyendo la proliferación celular, supervivencia, migración y diferenciación. Se han identificado varias aberraciones en la vía de señalización FGFR, debido a mutaciones o eventos de amplificación de genes, en varios tipos de cáncer. Por lo tanto, investigaciones recientes se han centrado en el desarrollo de estrategias que implican la focalización terapéutica de FFRRs. Inhibidores actuales de FGFR en varias etapas del desarrollo preclínico y clínico incluyen inhibidores de moléculas pequeñas de tirosina quinasas o anticuerpos monoclonales, con sólo unos pocos inhibidores a base de péptidos en la tubería. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza la tecnología de visualización de fagos para detectar pequeños péptidos como antagonistas de FGFR2. Brevemente, se incubaba una biblioteca de péptidos expuestos con fago sin fago en una placa recubierta de FGFR2. Posteriormente, TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20 se laupagó el fago no unido y eluyó con un tampón de 0,2 M de glicina-HCl (pH 2.2). El fago eludado se amplificabó aún más y se utilizó como entrada para la siguiente ronda de biopanning. Después de tres rondas de bioparlante, las secuencias de péptidos de clones individuales de fago fueron identificadas por secuenciación del ADN. Finalmente, los péptidos examinados fueron sintetizados y analizados para la afinidad y la actividad biológica.
Introduction
Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) desempeñan un papel clave en la proliferación celular, la cicatrización de heridas y la angiogénesis in vivo1. Activación aberrante de señalización FGFR observada en una variedad de tumores2,3,4,5 incluye amplificación de genes, mutaciones genéticas, aberraciones cromosómicas, y secreción excesiva de ligando6 . Muchos inhibidores dirigidos a los FFRBR han demostrado efectos terapéuticos prometedores en ensayos clínicos y se clasifican principalmente en tres tipos: (1) inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas, que se unen al dominio intracelular de FGFR, (2) antagonistas dirigidos a los segmento extracelular, y (3) ligando según el FGF6. Aunque varios de los inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas tienen buenos efectos terapéuticos tanto in vitro como in vivo7, la mayoría de ellos tienen mala especificidad objetivo y muestran efectos adversos como la hipertensión8. La mayoría de los antagonistas son anticuerpos monoclonales9,10 y polipéptidos11. Los péptidos tienen ventajas sobre moléculas pequeñas debido a su especificidad y efectos secundarios más bajos. También conservan la permeabilidad celular y no se acumulan en órganos específicos en comparación con los fármacos proteicos12. Por lo tanto, los péptidos pequeños dirigidos son agentes terapéuticos eficaces y prospectivos.
La tecnología de visualización Phage es una herramienta fácil pero poderosa para identificar pequeños péptidos que pueden unirse a una moléculadada 13,14,15. Utilizamos una biblioteca de péptidos de exhibición de fago que se basa en un simple fago M13 con más de 109 secuencias de péptidos diferentes que se muestran en la cola para la unión a la molécula objetivo (ver Tabla de Materiales)16. Debido a la alta afinidad de los fagos hacia la molécula dada, los fagos no unidos se pueden lavar, y sólo se conservan los fagos estrechamente unidos con los péptidos cortos deseados. Las dianas moleculares dadas pueden ser proteínas inmovilizadas17,18, carbohidratos, células cultivadas, o incluso materiales inorgánicos19,20. Se informó de un caso emocionante en el que se seleccionaron péptidos específicos de órganos in vivo utilizando la tecnología de visualización defagos 21. Las ventajas de la tecnología de visualización de fago sin embargo incluyen alto rendimiento, facilidad de operación, bajo costo y una amplia gama de aplicaciones22.
En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado de cribado de pequeños péptidos que se unen a la proteína inmovilizada (FGFR2) utilizando una biblioteca de visualización de fagos. La eficacia de la tecnología también se examina midiendo la afinidad del péptido obtenido hacia FGFR2 por Calorimetría de valoración isotérmica (ITC), y la actividad biológica mediante un ensayo de proliferación celular. El método puede extenderse para el cribado de pequeños péptidos que se unen a carbohidratos, células cultivadas, o incluso materiales inorgánicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una biblioteca combinatorial de fagos es una herramienta poderosa y eficaz para el cribado de alto rendimiento de péptidos novedosos que pueden unir moléculas diana y regular su función13. Actualmente, las bibliotecas de péptidos de pantalla de fago tienen una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, se pueden utilizar para seleccionar péptidos bioactivos unidos a proteínas receptoras23, objetivos no proteicos24,25…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (No. 2016201604030039).
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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