Screening e identificazione di piccoli peptidi mirati Fibroblast Growth Factor Receptor2 utilizzando una Phage Display Peptide Library
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening di piccoli peptidi che si legano a FGFR2 utilizzando una libreria di peptidi di visualizzazione del fago. Analizziamo ulteriormente l’affinità dei peptidi selezionati verso la FGFR2 in vitro e la sua capacità di sopprimere la proliferazione cellulare.
Abstract
La famiglia umana Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) comprende quattro membri, vale a dire FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4, che sono coinvolti in varie attività biologiche tra cui la proliferazione cellulare, la sopravvivenza, la migrazione e la differenziazione. Diverse aberrazioni nella via di segnalazione FGFR, a causa di mutazioni o eventi di amplificazione genica, sono state identificate in vari tipi di cancro. Di conseguenza, una recente ricerca si è concentrata sullo sviluppo di strategie che coinvolgono il targeting terapeutico dei FGFR. Gli inibitori attuali di FGFR in varie fasi dello sviluppo pre-clinico e clinico includono inibitori di piccole molecole di chinasi di tirosina o anticorpi monoclonali, con solo pochi inibitori a base di peptidi in cantiere. Qui, forniamo un protocollo utilizzando la tecnologia di visualizzazione dei fagi per lo screening di piccoli peptidi come antagonisti della FGFR2. In breve, una biblioteca di peptidi esposti ai fagi è stata incubata in una piastra rivestita con FGFR2. Successivamente, il fago non legato è stato lavato via dalla TBST (TBS – 0,1% [v/v] Tween-20), e il fago legato è stato eluito con buffer di glicina-HCl da 0,2 M (pH 2,2). Il fago eluito è stato ulteriormente amplificato e utilizzato come input per il prossimo ciclo di biopanning. A seguito di tre cicli di biopanning, le sequenze di peptidi dei singoli cloni di fago sono state identificate dal sequenziamento del DNA. Infine, i peptidi sottoposti a screening sono stati sintetizzati e analizzati per l’affinità e l’attività biologica.
Introduction
I recettori del fattore di crescita fibroblasto (FGCR) svolgono un ruolo chiave nella proliferazione cellulare, nella guarigione delle ferite e nell’angiogenesi in vivo1. Attivazione aberrante della segnalazione FGFR osservata in una varietà di tumori2,3,4,5 include amplificazione genica, mutazioni genetiche, aberrazioni cromosomiche e secrezione di ligando eccessiva6 . Molti inibitori mirati alle FGFR hanno dimostrato promettenti effetti terapeutici negli studi clinici e sono principalmente classificati in tre tipi: (1) piccoli inibitori della chinasi molecolare, che si legano al dominio intracellulare di FGFR, (2) antagonisti segmento extracellulare e (3) ligando FGFtrappole 6. Anche se molti degli inibitori della chinasi di piccole molecole hanno buoni effetti terapeutici sia in vitro che in vivo7,la maggior parte di loro ha una scarsa specificità del bersaglio e mostra effetti negativi come l’ipertensione8. La maggior parte degli antagonisti sono anticorpi monoclonali9,10 e polipeptidi11. I peptidi hanno vantaggi rispetto alle piccole molecole a causa della loro specificità e degli effetti collaterali più bassi. Inoltre trattengono la permeabilità cellulare e non si accumulano in organi specifici rispetto ai farmaci proteici12. Quindi, i piccoli peptidi mirati sono agenti terapeutici efficaci e potenziali.
La tecnologia di visualizzazione dei fagini è uno strumento facile ma potente per identificare piccoli peptidi che possono legarsi a una data molecola13,14,15. Abbiamo usato una libreria di peptidi di visualizzazione del fago che si basa su un semplice fago M13 con oltre 109 diverse sequenze di peptidi visualizzate alla coda per il legame alla molecola bersaglio (vedi Tabella dei materiali)16. A causa dell’alta affinità dei fagi verso la molecola data, i fagi non legati possono essere lavati via, e solo i fagi strettamente legati con i peptidi corti desiderati vengono mantenuti. Gli obiettivi molecolari indicati possono essere proteine immobilizzate17,18, carboidrati, cellule coltivate, o anche materiali inorganici19,20. È stato riportato un caso interessante in cui i peptidi specifici dell’organo sono stati selezionati in vivo utilizzando la tecnologia di visualizzazione dei faghi21. I vantaggi della tecnologia di visualizzazione dei faghi includono un’elevata produttività, facilità d’uso, basso costo e una vasta gamma di applicazioni22.
In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato di screening dei piccoli peptidi che si legano alla proteina immobilizzata (FGFR2) utilizzando una libreria di esposizione di fagi. L’efficacia della tecnologia viene esaminata anche misurando l’affinità del peptide ottenuto nei confronti della FGFR2 da Isothermal Titration Calorimetry (ITC), e l’attività biologica mediante un saggio di proliferazione cellulare. Il metodo può essere esteso per lo screening di piccoli peptidi che si legano a i carboidrati, cellule coltivate, o anche materiali inorganici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una libreria di fagi combinatori è uno strumento potente ed efficace per lo screening ad alta produttività di nuovi peptidi che possono legare le molecole bersaglio e regolare la loro funzione13. Attualmente, le librerie di peptidi di visualizzazione dei faocchi hanno una vasta gamma di applicazioni. Ad esempio, possono essere utilizzati per la selezione di peptidi bioattivi legati alle proteine recettoriali23, bersagli non proteici24,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Programma Scienza e Tecnologia di Guangzhou (N. 2016201604030039).
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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