سلامة حاجز الدم في الدماغ أمر بالغ الأهمية لوظيفة الجهاز العصبي. في دروسوفيلا melanogaster، يتكون حاجز الدم في الدماغ من الخلايا الغليفية أثناء تكوين الجنين في وقت متأخر. يصف هذا البروتوكول طرق اختبار تكوين حاجز الدم في الدماغ وصيانته في أجنة D. melanogaster واليرقات النجمية الثالثة.
تطوير الجهاز العصبي السليم يشمل تشكيل حاجز الدم في الدماغ، وحاجز الانتشار الذي ينظم بإحكام الوصول إلى الجهاز العصبي ويحمي الأنسجة العصبية من السموم ومسببات الأمراض. وقد ارتبطت العيوب في تشكيل هذا الحاجز مع الاعتلال العصبي، وقد لوحظ انهيار هذا الحاجز في العديد من الأمراض العصبية. ولذلك، من الأهمية بمكان تحديد الجينات التي تنظم تشكيل وصيانة حاجز الدم في الدماغ لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة. من أجل فهم الأدوار الدقيقة التي تلعبها هذه الجينات في التنمية العصبية، فمن الضروري تقييم آثار التعبير الجيني المتغير على سلامة حاجز الدم في الدماغ. وقد تم العثور على العديد من الجزيئات التي تعمل في إنشاء حاجز الدم في الدماغ ليتم حفظها عبر الأنواع eukaryotic، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، Drosophila melanogaster. وقد ثبت أن ذباب الفاكهة نظام نموذج ممتاز لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم تطوير الجهاز العصبي ووظيفته. يصف هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة للتدقيق في سلامة حاجز الدم في الدماغ خلال المراحل الجنينية واليرقات من تطور D. melanogaster.
أثناء التنمية، والاتصالات الخلية والتفاعلات حاسمة لإنشاء هيكل الأنسجة والأعضاء والوظيفة. في بعض الحالات، هذه التفاعلات الخلية الخلية ختم الأجهزة من البيئة المحيطة لضمان وظيفة الجهاز السليم. هذا هو الحال بالنسبة للجهاز العصبي، الذي هو معزول عن طريق حاجز الدم في الدماغ (BBB). وقد تم ربط خلل في BBB في البشر إلى الاضطرابات العصبية بما في ذلك الصرع، وقد لوحظ انهيار الحاجز في الأمراض العصبية بما في ذلك التصلب المتعدد والتصلب الجانبي الضموري1. في الثدييات ، يتكون BBB من تقاطعات ضيقة بين الخلايا البطانية2،3. الحيوانات الأخرى، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، دروسوفيلا melanogaster، لديها BBB تتألف من الخلايا الغليفية. هذه الخلايا الغليظة تشكل حاجزا نفاذيا انتقائيا للسيطرة على حركة المواد الغذائية، ومنتجات النفايات، والسموم، والجزيئات الكبيرة داخل وخارج الجهاز العصبي4. وهذا يسمح للحفاظ على التدرج الكهروكيميائي اللازم لإطلاق إمكانات العمل، مما يسمح للتنقل والتنسيق4. في D. melanogaster، وglia حماية الجهاز العصبي من الغنية بالبوتاسيوم ، مثل الدم الهيمولمف5.
في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والجهاز العصبي المحيطي (PNS) من D. melanogaster، طبقتين غليال الخارجي ، وglia subperineurial وglia العجان ، فضلا عن شبكة خارجية من المصفوفة خارج الخلية ، لاميلا العصبية ، تشكل الهيمولمفي الدماغ وحاجز العصب الهيمولمفي6, يشار إلى BBB في جميع أنحاء هذه المقالة. خلال التنمية subperineurial glia تصبح polyploidوتوسيع لتحيط الجهاز العصبي5،6،7،8،9،10،11 . وsubperineurial glia شكل تقاطعات الحاجز، والتي توفر حاجز الانتشار الرئيسي بين الهيمولمف والجهاز العصبي5،6،12. هذه التقاطعات هي مشابهة جزيئيا لتقاطعات تشبه الحاجز وجدت في paranodes من myelinating glia في الفقاريات، وأنها تؤدي نفس وظيفة تقاطعات ضيقة في BBB من الثدييات13،14، 15 , 16 سنة , 17.الفجوة غليا النجان، تنمو، والتفاف حول glia subperineurial لتنظيم انتشار الأيض والجزيئات الكبيرة6،10،18،19. اكتمال تشكيل BBB من قبل 18.5 ساعة بعد وضع البيض (AEL) في 25 درجة مئوية5،8. وقد حددت الدراسات السابقة الجينات التي هي المنظمين الحرجة لتشكيل BBB20،21،22. لفهم الأدوار الدقيقة لهذه الجينات بشكل أفضل، من المهم دراسة تأثير طفرة هذه المنظمين المحتملين على سلامة BBB. في حين حددت الدراسات السابقة نُهج اصالية في الأجنة واليرقات، إلا أن بروتوكولاً شاملاً لهذا الفحص لم يُوصف بعد5و7. يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة طرق لـ “وصف سلامة BBB” أثناء مراحل اليرقات الجنينية والثالثة.
يقدم هذا البروتوكول وصفاً شاملاً للخطوات اللازمة للتدقيق في سلامة BBB خلال المراحل الجنينية المتأخرة والثالثة من تطور الميلانينوغاستر. وقد تم وصف نُهج مماثلة في أماكن أخرى للتحقق من سلامة BBB أثناء التنمية، وكذلك في مراحل البالغين5و7و29</su…
The authors have nothing to disclose.
ويشكر المؤلفان الدكتور ف. براين بيكيت والدكتور رودني دايل على استخدام معدات للحقن. تم تمويل هذا العمل من خلال تمويل البحوث من جامعة لويولا شيكاغو إلى دكتوراه في الد، D.T.، وJ.J.
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
Active Dry Yeast | Red Star | ||
Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
Light Source | Schott | Ace I | |
Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |