Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila
Summary
L’intégrité de la barrière hémato-encéphalique est essentielle à la fonction du système nerveux. Dans Drosophila melanogaster, la barrière hémato-encéphalique est formée par les cellules gliales au cours de l’embryogenèse tardive. Ce protocole décrit les méthodes à essayer pour la formation et l’entretien de barrière hémato-encéphalique dans les embryons de D. melanogaster et les larves de troisième instar.
Abstract
Le développement approprié du système nerveux comprend la formation de la barrière hémato-encéphalique, la barrière de diffusion qui régule étroitement l’accès au système nerveux et protège les tissus neuronaux contre les toxines et les agents pathogènes. Des défauts dans la formation de cette barrière ont été corrélés avec des neuropathies, et la panne de cette barrière a été observée dans beaucoup de maladies neurodegenerative. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les gènes qui régulent la formation et le maintien de la barrière hémato-encéphalique pour identifier les cibles thérapeutiques potentielles. Afin de comprendre les rôles exacts de ces gènes dans le développement neuronal, il est nécessaire d’essayer les effets de l’expression génique altérée sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Beaucoup de molécules qui fonctionnent dans l’établissement de la barrière hémato-encéphalique se sont avérées être conservées à travers les espèces eucaryotes, y compris la mouche des fruits, Drosophila melanogaster. Les mouches des fruits se sont avérées être un excellent système modèle pour examiner les mécanismes moléculaires régulant le développement et la fonction du système nerveux. Ce protocole décrit une procédure étape par étape pour essayer l’intégrité de barrière hémato-encéphalique pendant les étapes embryonnaires et larvaires du développement de D. melanogaster.
Introduction
Pendant le développement, la communication et les interactions de cellule-cellule sont critiques pour établir la structure et la fonction de tissu et d’organe. Dans certains cas, ces interactions cellules-cellules scellent les organes de l’environnement environnant pour assurer le bon fonctionnement des organes. C’est le cas du système nerveux, qui est isolé par la barrière hémato-encéphalique (BBB). La dysfonction du BBB chez l’homme a été liée à des troubles neurologiques, y compris l’épilepsie, et la dégradation de la barrière a été observée dans les maladies neurodégénératives, y compris la sclérose en plaques et la sclérose latérale amyotrophique1. Chez les mammifères, le BBB est formé par des jonctions étroites entre les cellules endothéliales2,3. D’autres animaux, y compris la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, ont un BBB composé de cellules gliales. Ces cellules gliales forment une barrière sélectivement perméable pour contrôler le mouvement des nutriments, des déchets, des toxines et des grandes molécules dans et hors du système nerveux4. Cela permet le maintien du gradient électrochimique nécessaire pour tirer des potentiels d’action, permettant la mobilité et la coordination4. Dans D. melanogaster, la glie protège le système nerveux de l’hémolymphique riche en potassium et en forme de sang5.
Dans le système nerveux central (SNC) et le système nerveux périphérique (PNS) de D. melanogaster, deux couches gliales externes, la glie subperineuriale et la glie périnévriale, ainsi qu’un réseau externe de matrice extracellulaire, la lamelle neurale, forment le hémolymphe-cerveau et barrière hémolymphe-nerf6, dénommé le BBB tout au long de cet article. Pendant le développement des glissides subperineuriales deviennent polyploïdes et agrandissent pour entourer le système nerveux5,6,7,8,9,10,11 . Les glies subpériineuses forment des jonctions septates, qui fournissent la principale barrière de diffusion entre l’hémolymphe et le système nerveux5,6,12. Ces jonctions sont moléculairement similaires aux jonctions septates trouvées aux paranodes de la glie myélinisante chez les vertébrés, et elles remplissent la même fonction que les jonctions serrées dans le BBB des mammifères13,14, 15 Annonces , 16 Annonces , 17. Les glissides périnéales divisent, grandissent et s’enroulent autour de la glie subperineuriale pour réguler la diffusion des métabolites et des grandes molécules6,10,18,19. La formation de BBB est complète par 18,5 h après la ponte (AEL) à 25 oC5,8. Des études antérieures ont identifié des gènes qui sont des régulateurs critiques de la formation bBB20,21,22. Pour mieux comprendre les rôles exacts de ces gènes, il est important d’examiner l’effet de la mutation de ces régulateurs potentiels sur l’intégrité de BBB. Alors que des études antérieures ont décrit des approches pour l’analyse de l’intégrité BBB chez les embryons et les larves, un protocole complet pour cet essai n’a pas encore été décrit5,7. Ce protocole étape par étape décrit les méthodes d’analyse de l’intégrité bBB pendant les stades embryonnaires d’In. melanogaster et les troisièmes stades larvaires instar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole fournit une description complète des étapes nécessaires pour l’analyse de l’intégrité bBB au cours des derniers stades embryonnaires et troisièmes larvaires instar du développement de D. melanogaster. Des approches similaires ont été décrites ailleurs pour mettre en valeur l’intégrité de la BBB pendant le développement, ainsi que dans les stades adultes5,7,29,30</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr F. Bryan Pickett et le Dr Rodney Dale pour l’utilisation de l’équipement pour l’injection. Ces travaux ont été financés par le financement de la recherche de l’Université Loyola de Chicago à M.D., D.T., et J.J.
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
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