Summary

Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen

Published: December 03, 2019
doi:

Summary

Hier werden drei experimentelle Ansätze beschrieben, um die Dynamik der HIV-Infektion bei humanisierten Mäusen zu untersuchen. Die erste erlaubt die Untersuchung chronischer Infektionsereignisse, während letztere die Untersuchung akuter Ereignisse nach primärer Infektion oder viraler Reaktivierung ermöglicht.

Abstract

Humanisierte NOD/SCID/IL-2-Rezeptor-Null-Mäuse rekapitulieren einige Merkmale der menschlichen Immunität, die in der grundlegenden und präklinischen Forschung an Infektionskrankheiten genutzt werden können. Hier sind drei Modelle von humanisierten immundefizienten Mäusen beschrieben, um die Dynamik einer HIV-Infektion zu untersuchen. Die erste basiert auf der intrahepatischen Injektion von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen bei neugeborenen Mäusen, die die Rekonstitution mehrerer Blut- und Lymphgewebezellen ermöglicht, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von bis zu 36 Wochen nach der Infektion und wird daher als chronisches Modell bezeichnet. Das zweite und dritte Modell werden als die akuten und Reaktivierungsmodelle bezeichnet, bei denen periphere mononukleäre Blutzellen intraperitoneal in erwachsene Mäuse injiziert werden. Im akuten Modell werden Zellen eines gesunden Spenders über den intraperitonealen Weg transplantiert, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm. Schließlich werden im Reaktivierungsmodell Zellen eines HIV-infizierten Spenders unter antiretroviraler Therapie über den intraperitonealen Weg transplantiert. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung in der Maus eine Virusreaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben den konventionellen experimentellen Ansatz für humanisierte, immundefizienten Mausmodelle einer HIV-Infektion.

Introduction

Das humanisierte Mausmodell NOD/SCID/interleukin (IL)-2-Rezeptor-Chain null (im Folgenden als huNS-Kettenullbezeichnet) wurde häufig zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen, Autoimmunität und Krebs sowie für präklinische Studien von Medikamenten und humanzellbasierten Therapien1,2verwendet. Diese Mäuse basieren auf einem nicht-fettleibigen Diabetiker (NOD) Hintergrund, mit der scid-Mutation und gezielten Mutation am IL-2-Rezeptor-Ketten-Lokus (gemeinsame Kette für IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 und IL-21), die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B-, und natürlichen Killerzellen (NK) verursachen, die eine schwere Beeinträchtigung in der Entwicklung von Maus-T-, B- und natürlichen Killerzellen (NK)verursachen. So unterstützen sie die Engraftierung von menschlichem Gewebe, humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)3,4,5. Darüber hinaus fördert die transgene Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren, wie Stammzellenfaktor (SCF), Granulozyt/Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), und IL-3 die Engraftmentierung menschlicher Myeloidpopulationen6,7,8.

Für HIV-Studien wurden mehrere huNS-Kette Null-Maus-Modelle beschrieben, die sich in der Maus Stamm, Art der verwendeten menschlichen Zellen, Art des Gewebes für die Engraftment und Herkunft der Zellen (d.h. gesund vs. HIV-infizierter Spender)9,10. Der ursprüngliche Stamm ist jedoch aufgrund der hohen Konzentration menschlicher Zellen und der Virusreplikation nach einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm11,12,13weit verbreitet. Ähnliche immundefiziöse Mausstämme mit transgener Expression menschlicher hämatopoetischer Faktoren (z. B. NOG-EXL oder NSG-SGM3) oder mit Implantaten menschlicher Leber- und Thymusgewebe (Knochenmark-Leber-Thymus [BLT]-Mäuse) sind nützlich für die Bewertung der Rolle von Myeloidpopulationen bei der Anti-HIV-Immunantwort, den Auswirkungen von HIV auf diese Gewebe und deren Beteiligung als Virusreservoir14,15. Darüber hinaus können einige Stämme mit transgener Expression von humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Molekülen sowie BLT-Mäusen zur Untersuchung der T-Zell-Reaktion auf HIV-Infektionen16,17verwendet werden.

Im Allgemeinen hängt die Humanisierung bei diesen Mäusen vom zellulären Ursprung, dem Verabreichungsweg (intraperitoneal, intrahepatisch, intravenös, intrakardial) und dem Mausalter zum Zeitpunkt der Transplantation18,19,20ab. In Bezug auf den Zellursprung können menschliche CD34+ HSC aus Nabelschnurblut, fetaler Leber oder mobilisiertem peripherem Blut bei neugeborenen oder jungen Mäusen injiziert werden3,21. Darüber hinaus können erwachseneNull-Mäuse durch Injektion von PBMC (hier als hu-PBL-NS-Kettenull-Mäuse bezeichnet) humanisiert werden, was die zeitliche Zirkulation dieser Zellen im Blut, sekundären Lymphorganen und entzündeten Geweben22,23,24ermöglicht.

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Etablierung von huNS-Kette Null-Maus-Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektionen beschrieben. Das erste ist das chronische Modell, bei dem menschliche CD34+ HSCs, die aus Nabelschnurblut von einem gesunden Spender stammen, bei neugeborenen Mäusen injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 14 Wochen Rekonstitution des menschlichen Immunsystems. Dieses Modell ermöglicht die Überwachung von Mäusen für bis zu 36 Wochen nach der Infektion. Das zweite Modell ist ein akutes Modell, bei dem PBMCs, die von einem gesunden Spender abgeleitet wurden, in erwachsene NS-Kettenull Mäuse injiziert werden, gefolgt von einer Infektion mit einem Referenz-HIV-Stamm nach 3 Wochen menschlicher T-Zell-Expansion in der Maus. Das dritte Modell schließlich ist das Reaktivierungsmodell, bei dem PBMCs, die von einem HIV-infizierten Spender im Rahmen einer unterdrückenden antiretroviralen Therapie (ART) abgeleitet wurden, in adulte NS-Kettenull Mäuse injiziert werden. In diesem Fall ermöglicht eine medikamentenfreie Umgebung eine virale Reaktivierung und eine Erhöhung der Viruslast. Die beiden letztgenannten Modelle ermöglichen eine Überwachung von bis zu 9 Wochen nach der Transplantation.

Insgesamt sind diese drei Modelle nützlich für virologische Studien, präklinische Studien neuartiger Medikamente und die Bewertung der Auswirkungen von HIV-Infektionen auf die globale Immunantwort. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass die Verwendung von HIV-infizierten humanisierten Mäusen vor jedem Experiment eine Überprüfung und Genehmigung durch den Institutional Biosafety Committee (IBC) sowie durch den Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) erfordert. Dadurch wird sichergestellt, dass die Studie alle internen und externen institutionellen Vorschriften für die Verwendung von gefährlichem biologischem Material und den humanen Umgang mit Versuchstieren befolgt.

Protocol

Bei dieser Arbeit wurden alle Tierpflege- und -verfahren nach Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland School of Medicine überprüft und genehmigt wurden (Protokollnummern 1018017, 1018018 und 0318009). 1. Humane CD34+ HSC-Transplantation von neugeborenen Mäusen Verwenden Sie immer Einweg-Personenschutzausrüstung (PPE), einschließlich steriler Peelings, Handschuhe, spezielle Schuhe, Schuhbezüge, …

Representative Results

Wie oben beschrieben, werden die Mäuse nach 14 Wochen nach der HSC-Injektion (chronisches Modell) oder nach 3 Wochen nach der PBMC-Injektion (akute und Reaktivierungsmodelle) zum Screening des Niveaus der Enpfropz menschlicher Zellen durch Durchflusszytometrie ausgeblutet. Eine repräsentative Gating-Strategie für die Bewertung von 1) menschlichen CD45+ Zellen Rekonstitution und 2) Prozentsatz von CD4+ und CD8+ T-Zellen ist in Abbildung 1Ad…

Discussion

Wichtige Fortschritte wurden bei der Entwicklung von immundefizienten Mausstämmen für die Humanisierung erzielt, mit einer Reihe von verschiedenen Optionen, die je nach Forschungsinteresse verwendet werden können1. Hier ist ein allgemeines Protokoll zur Humanisierung von NS-Kettenull Mäuse n und genetisch ähnliche Stämme in drei verschiedenen Modellen für die Untersuchung von HIV-Infektion verwendet werden. Im ersten experimentellen Ansatz werden bestrahlte neugeborene Mäuse mit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den internen Fonds der Klinischen Abteilung IHV an JCZ unterstützt.

Materials

0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

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Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

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