Infezione da HIV cronica, acuta e riattivata in modelli di topo immunodeficienti umanizzati
Summary
Qui sono descritti tre approcci sperimentali per studiare la dinamica dell’infezione da HIV nei topi umanizzati. Il primo consente lo studio di eventi di infezione cronica, mentre i due ultimi consentono lo studio di eventi acuti dopo l’infezione primaria o la riattivazione virale.
Abstract
I topinulli umanizzati NOD/SCID/IL-2 ricapitolano alcune caratteristiche dell’immunità umana, che possono essere sfruttate nella ricerca di base e pre-clinica sulle malattie infettive. Qui sono descritti tre modelli di topi immunodeficienti umanizzati per studiare la dinamica dell’infezione da HIV. Il primo si basa sull’iniezione intraepatica di CD34– cellule staminali ematopoietiche nei topi neonati, che consente la ricostituzione di diverse cellule confinate nel sangue e nel linfoide, seguita da infezione con un ceppo HIV di riferimento. Questo modello consente il monitoraggio fino a 36 settimane dopo l’infezione ed è quindi chiamato il modello cronico. Il secondo e il terzo modello sono indicati come modelli acuti e di riattivazione, in cui le cellule mononucleari del sangue periferico vengono iniettate intraperitonealmente nei topi adulti. Nel modello acuto, le cellule di un donatore sano vengono innestate attraverso il percorso intraperitoneale, seguito da infezione con un ceppo HIV di riferimento. Infine, nel modello di riattivazione, le cellule di un donatore infetto dall’HIV sottoposto a terapia antiretrovirale vengono innestate attraverso il percorso intraperitoneale. In questo caso, un ambiente privo di farmaci nel mouse consente la riattivazione del virus e un aumento del carico virale. I protocolli qui forniti descrivono l’approccio sperimentale convenzionale per i modelli murini umanizzati e immunodeficienti dell’infezione da HIV.
Introduction
Il modello murino umorizzato NOD/SCID/interleukin (IL)-2 receptor-chainnull (qui di seguito indicato come huNS-chainnull) è stato ampiamente utilizzato per studiare la patogenesi delle infezioni, l’autoimmunità e il cancro, così come per gli studi preclinici di farmaci e terapie basate su cellule umane1,2. Questi topi sono basati su un background non obeso diabetico (NOD), con la mutazione scid e mutazione mirata al locus a catena del recettore IL-2 (comune catena z per IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), che provocano una grave compromissione nello sviluppo delle cellule T-, B-, naturali e (NK killer)1. Così, essi sostengono l’innesto di tessuto umano, il CD34 umano– cellule staminali ematopoietiche (HSC) e le cellule mononucleari periferiche umane (PBMC)3,4,5. Inoltre, l’espressione transgenica di fattori ematopoietici umani, come il fattore delle cellule staminali (SCF), il fattore di stimolazione della colonia di granulociti/macrofasi (GM-CSF) e IL-3 promuove l’innesto delle popolazioni mieloidi umane6,7,8.
Per gli studi sull’HIV, sono stati descritti diversi modelli di toponull huNS a catena, che differiscono nel ceppo del topo, nel tipo di cellule umane utilizzate, nel tipo di tessuti per l’innesto e nell’origine delle cellule (cioè sane vs. donatore infetto dall’HIV)9,10. Il ceppo originale, tuttavia, è ampiamente utilizzato a causa degli alti livelli di innesto di cellule umane e della replicazione virale a seguito di infezione con un ceppo HIV di riferimento11,12,13. Ceppi di topi immunodeficienti simili con espressione transgenica di fattori ematopoietici umani (ad es. NOG-EXL o NSG-SGM3) o con impianti di fegato e timo umano (topogonico osseo-fegato-fegato [BLT]) sono utili per valutare il ruolo delle popolazioni mieloidi nella risposta immunitaria anti-HIV, gli effetti dell’HIV su questi tessuti e la loro partecipazione come serbatoi virali14,15. Inoltre, alcuni ceppi con espressione transgenica di molecole di antigene leucocito umano (HLA), così come topi BLT, possono essere utilizzati per studiare la risposta delle cellule T all’infezione da HIV16,17.
In generale, in questi topi, l’umanizzazione dipende dall’origine cellulare, dal percorso di consegna (intraperitonetale, intraepatico, endovenoso, intracardiaco) e dall’età del topo al momento dell’innesto18,19,20. Per quanto riguarda l’origine cellulare, l’uomo CD34– HSC derivato dal sangue cordonale, dal fegato fetale o dal sangue periferico mobilitato può essere iniettato nei neonati o nei giovani topi3,21. Inoltre, i topinulli adulti a catena possono essere umanizzati con l’iniezione di PBMC (qui, indicati come hu-PBL-NS-catena zz), permettendo la circolazione temporale di queste cellule nel sangue, organi linfoidi secondari e tessuti infiammati22,23,24.
Descritto qui è un protocollo dettagliato per la creazione di modelli di toponull huNS -catena per lo studio dell’infezione da HIV. Il primo è il modello cronico, in cui i CD34umani – HSC derivati dal sangue cordonale da un donatore sano vengono iniettati nei topi neonati, seguito da infezione con un ceppo HIV di riferimento dopo 14 settimane di ricostituzione del sistema immunitario umano. Questo modello permette il monitoraggio dei topi fino a 36 settimane dopo l’infezione. Il secondo modello è un modello acuto, in cui i PbMC derivati da un donatore sano vengono iniettati in topinull adulti NS , seguiti da infezione con un ceppo HIV di riferimento dopo 3 settimane di espansione delle cellule T umane nel topo. Infine, il terzo modello è il modello di riattivazione, in cui i PMC derivati da un donatore infetto dall’HIV sottoposto a terapia antiretrovirale soppressiva (ART) vengono iniettati nei topinulli adulti NS – catena. In questo caso, un ambiente privo di farmaci consente la riattivazione virale e l’aumento del carico virale. Questi due ultimi modelli consentono il monitoraggio fino a 9 settimane dopo l’innesto.
Nel complesso, questi tre modelli sono utili per studi virologici, studi preclinici su nuovi farmaci e valutazione degli effetti dell’infezione da HIV sulla risposta immunitaria globale. È inoltre importante considerare che l’uso di topi umanizzati affetti da HIV richiede la revisione e l’approvazione da parte del Comitato di Biosicurezza Istituzionale (IBC) e dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) prima di qualsiasi esperimento. Ciò garantisce che lo studio segua tutte le normative istituzionali interne ed esterne per l’uso di materiale biologico pericoloso e la manipolazione umana di animali sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Importanti progressi sono stati raggiunti nello sviluppo di ceppi di topi immunodeficienti per l’umanizzazione, con una serie di diverse opzioni che possono essere utilizzate in base all’interesse della ricerca1. Fornito qui è un protocollo generale per l’umanizzazione dei topinulli NS -catena-catena e ceppi geneticamente simili da impiegare in tre diversi modelli per studiare l’infezione da HIV. Nel primo approccio sperimentale, i topi appena nati irradiati vengono iniettati con CD34 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dai fondi interni della divisione clinica IHV a JC .
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
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