마이크로웰 배양을 이용한 고환 특이적 구조를 이용한 돼지 고환 오르가노이드 생성
Summary
여기서, 우리는 시판되는 마이크로웰 배양 시스템을 사용하여 고환 특이적 조직 구조를 가진 돼지 고환 오르가노이드의 재현 가능한 생성을 위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
오르가노이드는 생체 내에서 장기의 조직 구조 와 기능을 재량화 할 수있는 여러 세포 유형으로 구성된 3 차원 구조입니다. 오르가노이드의 형성은 기본 및 번역 연구의 다른 길을 열었습니다. 최근 몇 년 동안, 고환 오르가노이드는 남성 생식 생물학 분야에 대한 관심을 얻고있다. 고환 오르가노이드는 세포-세포 상호 작용, 조직 발달 및 세균 세포 틈새 미세 환경의 연구를 허용하고 높은 처리량 약물 및 독성 스크리닝을 용이하게 합니다. 고환 특정 조직 아키텍처를 가진 고환 오르가노이드를 믿을 수 있고 재현가능하게 생성하는 방법이 필요합니다. 마이크로웰 배양 시스템은 피라미드 모양의 마이크로웰의 조밀한 배열을 포함합니다. 전 사춘기 고환에서 파생된 고환 세포는 이 마이크로웰로 원심분리되고 고환 특정 조직 건축 및 세포 협회를 가진 고환 오르가노이드를 생성하기 위하여 배양됩니다. 이 과정을 통해 수천 개의 균일 한 오르가노이드를 생성 할 수 있습니다. 여기에보고된 프로토콜은 남성 생식을 연구하는 연구자들에게 광범위한 관심사가 될 것입니다.
Introduction
최근에는 3차원(3D) 오르가노이드에 대한 관심이 다시 부호 높아지고 있습니다. 장1,위2,췌장3,4,간5,뇌6 과 같은 다른 장기는 성공적으로 3D 오르가노이드 시스템으로 파생되었습니다. 이들 오르가노이드는 생체내 장기에 대한 건축적 및 기능적 유사성을 가지며 단층 배양 시스템7보다조직 미세환경연구에 생물학적으로 더 관련성이 있다. 그 결과, 고환 오르가노이드는8,9,10,11,12뿐만아니라 관심을 얻기 시작했다. 지금까지 보고된 방법의 대부분은 복잡하고, 비높은처리량(10)이며 ECM 단백질8,10의첨가가 필요하다. 이러한 복잡성은 재현성 문제도 발생합니다. 간단하고 재현 가능한 방법은 생체 내에서 고환과 같은 세포 협회와 고환 오르가노이드의 생성을 허용하는 것이 필요하다.
우리는 최근에 이러한 요구 사항을 해결하는 시스템을보고했다12. 돼지를 모델로 사용하여 마이크로웰 시스템에서 원심 강제 응집 방식을 사용했습니다. 마이크로웰 시스템에서, 각 웰은 동일한 작은마이크로웰(13)을다수 함유한다. 이것은 균일 한 크기의 수많은 스페로이드의 생성을 허용한다. 마이크로웰 시스템은 고환 별 아키텍처를 갖춘 많은 수의 균일한 오르가노이드를 생성할 수 있었습니다. 이 시스템은 간단하며 ECM 단백질을 첨가할 필요가 없습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 생체 내 고환과 유사한 조직 구조를 가진 많은 수의 고환 오르가노이드의 일관되고 반복 가능한 생성을 허용하는 간단한 방법을 확립했습니다12. 접근법은 돼지 고환 세포를 사용하여 개발되었지만, 마우스, 비인간 영장류 및 인간고환(12)에도보다 광범위하게 적용가능하다. 고환 오르가노이드8,9,10,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH / NICHD HD091068-01 박사 에 의해 지원되었다 박사 Ina 도브린스키.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
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