Geração de organóides testicular porcina com a arquitetura específica do testis usando a cultura de micropoços
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para a geração reprodutível de organóides testicular suínos com a arquitetura específica do tecido do testis usando o sistema comercialmente disponível da cultura do de micropoços.
Abstract
Os organóides são estruturas tridimensionais compostas de múltiplos tipos de células capazes de recapitular a arquitetura do tecido e as funções dos órgãos in vivo. A formação de organóides abriu diferentes avenidas de pesquisa básica e translacional. Nos últimos anos, os organóides testicular têm ganhou interesse no campo da biologia reprodutiva masculina. Os organóides testiculares permitem o estudo de interações célula-célula, desenvolvimento tecidual, e o microambiente de nicho de células germinativas e facilitam a triagem de drogas e toxicidade de alta taxa de transferência. Um método é necessário para gerar de forma confiável e regerível organóides testiculares com o testículo tecido específico arquitetura. O sistema da cultura do de micropoços contem uma disposição densa de micropoços pirâmide-dados forma. As pilhas testicular derivadas dos testículos pre-pubertal são centrifugadas nestes micropoços e cultivadas para gerar organóides testicular com a arquitetura testis-específica do tecido e as associações da pilha. Milhares de organóides homogêneos podem ser gerados através deste processo. O protocolo aqui relatado será de grande interesse para os pesquisadores que estudam a reprodução masculina.
Introduction
Nos últimos anos, houve um ressurgimento do interesse em três-dimensional (3D) organóides. Os órgãos diferentes tais como o intestine1, o estômago2, o pâncreas3,4, ofígado5, eo cérebro6 foram derivados com sucesso em sistemas organoid 3D. Estes organóides têm semelhanças arquitetônicas e funcionais com os órgãos in vivo e são mais biologicamente relevantes para o estudo do microambiente tecidual do que os sistemas de cultura monocamada7. Como resultado, os organóides testicular começaram a angariar juros, bem como8,9,10,11,12. A maioria dos métodos relatados até o momento são complexos, não-alta taxa de transferência10 e exigem a adição de proteínas ECM8,10. Essa complexidade também leva a problemas de reprodutibilidade. Um método simples e reprodutível é necessário que permite a geração de organóides testiculares com células-associações que são como testis in vivo.
Nós temos relatado recentemente um sistema para endereçar estas exigências12. Usando o porco como modelo, empregamos uma abordagem de agregação forçada centrífuga no sistema de micropoços. No sistema micropoços, cada poço contém um grande número de micropoços menores idênticos13. Isto permite a geração de esferoides numerosos do tamanho uniforme. O sistema de micropoços permitiu a geração de um grande número de organóides uniformes com uma arquitetura específica do testis. O sistema é simples e não requer adição de proteínas ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estabelecemos um método simples que permite a geração consistente e repetível de um grande número de organóides testiculares com arquitetura tecidual que é semelhante ao testis in vivo12. Quando a aproximação foi desenvolvida usando pilhas do testis suínos, é mais extensamente aplicável também ao rato, ao primata não-humano e ao testis humano12. Um número de métodos diferentes foi relatado para produzir organóides testicular8,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por NIH/NICHD HD091068-01 a Dr. ina Dobrinski.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
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