用于下游分析的冷冻啮齿动物大脑区域集合
Summary
此过程描述了离散冷冻大脑区域的收集，以便使用廉价和常用的工具获得高质量的蛋白质和RNA。
Abstract
随着我们对神经生物学的理解不断进步，分子分析通常对小大脑区域进行，如前额叶皮质（mPFC）或核积液。这项工作面临的挑战是解剖正确的区域，同时保留要检查的微观环境。在本文中，我们描述了一种使用大多数实验室中现成的资源的简单、低成本的方法。这种方法通过在整个过程中保持组织冻结来保存核酸和蛋白质。大脑使用大脑矩阵被切成0.5~1.0毫米的部分，并排列在冰冻的玻璃板上。每个部分中的地标都与参考进行比较，例如艾伦老鼠脑图集，并使用冷手术刀或活检冲孔对区域进行解剖。然后，组织在-80°C下储存，直到使用。通过这一过程，利用qRT-PCR和西式测定，成功地分析了大鼠和小鼠mPFC、核积液、背和内膜海马和其他区域。此方法仅限于大脑区域，可以通过清晰的地标识别。
Introduction
本研究说明了用参考（如艾伦小鼠脑图集1）提取高质量核酸或蛋白质的冷冻大脑区域的剖面图。在这种技术中，大脑被闪速冷冻，储存在-80°C，以便以后在冷冻条件下进行解剖和解剖。这个过程允许研究人员在一个会话中收获大量的大脑，然后对其进行解剖，以便准确收集多个大脑区域。
在回答与基因和蛋白质表达有关的问题时，通常需要准确收集感兴趣的大脑区域（ROIs）。虽然药理学、电生理学和光遗传学可用于野生型或转基因啮齿动物，以帮助阐明支持观察到行为22、3、43,4的分子变化，但记录和蛋白酶诱导变化的测量常用于支持这些发现。定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）、西印、RNAseq 5、MAPSeq56和HPLC7等技术稳健，成本相对较低，使许多实验室能够研究小脑区2、4、5、64,5,6中的诱导分子2变化。
有几种方法可以,从大脑区域8、9、10、11、129,10提取和纯化核酸811或12蛋白质。许多实验室在收获99、1313时，通过冷却和在冰上切割大脑来收获大脑区域。虽然这种方法可以产生高质量的核酸和蛋白质，但它在一定程度上是有限度的，因为组织微环境中的降解可能发生在这些温度下。当尝试一次解剖大量动物或ROIs时，情况可能尤其如此。保持样品冷冻有助于保持实验室目标分子，同时为研究人员提供时间仔细比较每个部分两侧的地标，以收集相对纯净的样品。激光捕获是从大脑区域10收集RNA或蛋白质分析组织的另一种方法。此过程优于机械解剖，因为可以识别和隔离非常小且形状不规则的 ROI。然而，激光捕获受到昂贵设备和试剂的使用的限制，非常耗时，而且可能更容易样品降解。
冷冻组织的微冲压解剖并不新鲜。米克洛斯·帕尔科维茨等人的早期论文详细描述了基本技术14、15。,15本演示主要遵循原始工作，并进行了一些改进，以提高效率和降低所需设备的费用。例如，大脑部分是在冰冻的大脑块，而不是在低温。这将生成较厚的部分，从而减少收集 ROI 样本所需的部分数。此方法还解剖了位于绝缘盒内干冰上的冷冻玻璃板上的样品。这将在工作台的长凳上产生一个亚冻结阶段。以这种方式解剖的部分很容易操作，使研究人员能够将每个部分的两侧与参考进行比较，以限制来自所需 ROI 以外的区域的污染。
该协议的优点是：1） 大脑在整个过程中保持冷冻状态，这有助于保存蛋白质和核酸，并给研究人员时间仔细收获ROIs，2） 所需的试剂价格低廉，在大多数分子生物学实验室中都有发现。在这个过程中，整个大脑被分割到0.5~1.0毫米的大脑矩阵中，并放置在一个冷冻玻璃板上，不断用干冰冷却。在艾伦脑图集1或其他大脑地图集16，17,17中发现的地标用于识别感兴趣的区域，然后使用冷拳或手术刀进行解剖。由于组织从未解冻，以这种方式收获的区域为下游分析提供高质量的RNA和蛋白质。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究描述了一种分离大脑小而特定区域，同时限制核酸和蛋白质降解的技术。一旦有机体死亡，对脑组织的损伤就会迅速发生。这是部分由于细胞外谷氨酸的快速积累和由此产生的兴奋毒性发生21。信使RNA特别容易受到降解22，23。22,蛋白质和核酸的分解在低温下大大减少，最近一篇文章描述了28，000年前冷冻在永冻…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH、DA043982和DA046196的支持。
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
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