Коллекция замороженных регионов мозга грызунов для анализа вниз по течению

Summary

Эта процедура описывает сбор дискретных замороженных областей мозга для получения высококачественного белка и РНК с использованием недорогих и общедоступных инструментов.

Abstract

По мере того как наше вникание нейробиологии развивало, молекулярные анализы часто выполняются на малых зонах мозга such as медиальная префронтальная кора (mPFC) или accumbens ядра. Задача этой работы состоит в том, чтобы вскрыть правильную область при сохранении микросреды, которая будет рассмотрена. В этой статье мы описываем простой, недорогой метод с использованием ресурсов, легко доступных в большинстве лабораторий. Этот метод сохраняет нуклеиновой кислоты и белков, сохраняя ткани замороженными на протяжении всего процесса. Мозги разрезают на 0,5-1,0 мм с помощью матрицы мозга и устроены на замороженной стеклянной пластине. Ориентиры в каждом разделе сравниваются со ссылкой, такие как Аллен мышь мозга Атлас, и регионы вскрыты с помощью холодного скальпеля или биопсии удар. Ткань затем хранится при -80 градусах Цельсия до использования. Благодаря этому процессу крыса и мышь mPFC, ядро accumbens, дорсальный и брюшной гиппокамп и другие регионы были успешно проанализированы с помощью qRT-PCR и западных анализов. Этот метод ограничен областями мозга, которые могут быть определены четкими ориентирами.

Introduction

Эта работа иллюстрирует вскрытие замороженных областей мозга для извлечения высококачественной нуклеиновой кислоты или белка с помощью ссылки, такие как Аллен Мышь мозга Атлас¹, в качестве руководства. В этом методе мозги замораживаются вспышкой и хранятся при -80 градусов по Цельсию для последующего отделения и вскрытия при сохранении в замороженном состоянии. Этот процесс позволяет исследователю собрать большое количество мозгов за один сеанс, а затем вскрыть их для точного сбора нескольких областей мозга.

Точный сбор областей мозга, представляющих интерес (ROIs) часто требуется при ответе на вопросы, связанные с геном и выражением белка. В то время как фармакология, электрофизиология и оптогенетика могут быть использованы на wildtype или генетически модифицированных грызунов, чтобы помочь прояснить молекулярные изменения, лежащие в основе наблюдаемого поведения^2,3,4, измерение индуцированных изменений в транскриптомах и протеом часто используется для поддержки этих выводов. Такие методы, как количественные обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-qPCR), западные blotting, RNAseq⁵, MAPSeq⁶ и HPLC⁷ являются надежными и относительно низкими по стоимости, что позволяет многим лабораториям для изучения индуцированных молекулярных изменений в малых областях мозга^2,4,5,6.

Есть несколько способов извлечения и очищения нуклеиновой кислоты или белка из областей мозга^{8,,9,,10,,11,,12}. Многие лаборатории собирают мозг регионов путем охлаждения и резки мозгов на льду во время сбора урожая^9,13. Хотя такой подход может привести к высокому качеству нуклеиновой кислоты и белка, он несколько ограничен по времени, поскольку деградация в микроокружении тканей может происходить при таких температурах. Это может быть особенно верно при попытке вскрыть большое количество животных или roIs в один присест. Сохранение образцов замороженных помогает поддерживать молекулы-цели лабила, обеспечивая исследователю время, чтобы тщательно сравнить ориентиры с обеих сторон каждого раздела в попытке собрать относительно чистые образцы. Лазерный захват является еще одним способом сбора ткани для РНК или анализа белка из областей мозга¹⁰. Эта процедура превосходит механическое вскрытие в том, что очень маленькие и неправильной формы ROIs могут быть определены и изолированы. Однако лазерный захват ограничен использованием дорогостоящего оборудования и реагентов, занимает много времени, а также может быть более восприимчив к деградации образцов.

Вскрытие микропунда на замороженных тканях не ново. Ранние работы Миклоша Палковича и других подробно описывают основные методы^14,,15. Эта презентация в значительной степени соответствует первоначальной работе, с некоторыми улучшениями для облегчения эффективности и сокращения расходов на оборудование, необходимое. Например, участки мозга сделаны в замороженном мозговом блоке, а не на криостате. Это приводит к более толстым секциям, что уменьшает количество секций, необходимых для сбора образцов окупаемое окупаемое инвестиций. Этот метод также вскрывает образцы на замороженной стеклянной пластине, которая сидит на сухом льду в изолированной коробке. Это создает под-замораживания этапе на скамейке, на которой работать. Разделы, расчлененные таким образом, легко манипулируют, что позволяет исследователю сравнивать обе стороны каждого раздела со ссылкой, чтобы ограничить загрязнение из регионов за пределами желаемой рентабельности инвестиций.

Преимущества этого протокола в том, что 1) мозг находится в замороженном состоянии на протяжении всего процесса, что помогает сохранить белок и нуклеиновой кислоты и дает исследователю время, чтобы тщательно собирать ROIs, и 2) реагенты, необходимые являются недорогими и находятся в большинстве лабораторий молекулярной биологии. В этом процессе целые мозги разделены до 0,5-1,0 мм в матрице мозга и помещаются на замороженную стеклянную пластину, которая постоянно охлаждается сухим льдом. Ориентиры, найденные в Атласе мозга Аллена¹ или других атласах мозга^16,17 используются для выявления областей, представляющих интерес, которые затем вскрыты с помощью либо холодный пунш или скальпель. Поскольку ткань никогда не оттаяла, регионы, собранные таким образом, обеспечивают высокое качество РНК и белка для анализа ниже по течению.

Protocol

К животным, использованным в этом исследовании, относились этически и гуманно, как это предусмотрено Руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных Университета Индианы (IACUC) и Национальными институтами здравоохранения (NIH). ПРИМЕ…

Representative Results

Для того, чтобы проверить этот метод, медиальная префронтальная кора была собрана из взрослых CD1 диких мышей дикого типа и РНК и белка были извлечены и охарактеризованы. РНК была проанализирована с помощью капиллярного электрофорасиса. Деградированная РНК отображает потерю интенсивно…

Discussion

Эта работа описывает метод изолировать небольшие, специфические области мозга, ограничивая деградацию нуклеиновой кислоты и белка. Повреждение тканей мозга происходит быстро, как только организм умирает. Это частично связано с быстрым накоплением внеклеточного глутамата и в результ?…

Materials

0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue