Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der In-vivo-Lokalisierung von Antikörpern in Mäusetumor-Xenograft-Modellen vor.
Abstract
Monoklonale Antikörper sind hochaffine multifunktionale Medikamente, die durch variable unabhängige Mechanismen arbeiten, um Krebszellen zu eliminieren. In den letzten Jahrzehnten hat sich das Feld der Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, bispezifischen Antikörper, chimären Antigenrezeptoren (CAR) und Krebsimmuntherapie als der vielversprechendste Bereich der grundlegenden und therapeutischen Untersuchungen herauskristallisiert. Mit zahlreichen erfolgreichen Studien am Menschen, die auf Immun-Checkpoint-Rezeptoren und CAR-T-Zellen bei Leukämie und Melanom in einem bahnbrechenden Tempo abzielen, sind es hochspannende Zeiten für onkologische Therapeutika, die aus Variationen der Antikörpertechnik abgeleitet sind. Bedauerlicherweise hat sich eine signifikant große Anzahl von Antikörpern und CAR-basierten Therapeutika auch in Studien am Menschen mit soliden Krebsarten als enttäuschend erwiesen, da Immuneffektorzellen im Tumorbett nur begrenzt zur Verfügung stehen. Wichtig ist, dass die unspezifische Verteilung von therapeutischen Antikörpern in anderen Geweben als Tumoren auch zum Mangel an klinischer Wirksamkeit, damit verbundener Toxizität und klinischem Versagen beiträgt. Da die getreue Übersetzung präklinischer Studien in klinische Pfade am Menschen in hohem Maße auf Dieko-Effizienz- und Sicherheitsstudien von Mäusen beruht, heben wir hier eine Methode zur Untersuchung des Tumors und der allgemeinen Gewebeverteilung von therapeutischen Antikörpern hervor. Dies wird durch die Kennzeichnung des protein-A-gereinigten Antikörpers mit einem nahen Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff erreicht, gefolgt von einer Live-Bildgebung von tumortragenden Mäusen.
Introduction
Die FDA genehmigte 1986 den ersten monoklonalen Antikörper gegen CD3 (OKT3, Muromonab)1,2. Seitdem hat es in den nächsten zwanzig Jahren eine schnelle Explosion im Bereich der Antikörpertechnik gegeben, aufgrund des überwältigenden Erfolgs von Antikörpern gegen Immun-Checkpoint-Inhibitoren3. Neben der indirekten Aktivierung des Immunsystems zielen Antikörper darauf ab, Krebszellen direkt zu kennzeichnen, um Immuneffektorzellen präzise zu aktivieren, Zytotoxizität über Todesrezeptor-Agonisten auszulösen, Tumorzellüberlebenssignale zu blockieren, Angiogenese zu behindern (Wachstum der Blutgefäße), Immun-Checkpoint-Regler einzuschränken, Radioisotope, Chemotherapie-Medikamente und siRNA als konjugierte Wirkstoffe zu liefern2. Darüber hinaus ist die Untersuchung der einkettigen variablen Fragmente (scFv) verschiedener Antikörper auf der Oberfläche von patientenabgeleiteten T-Zellen und NK-Zellen (CAR-T und CAR-NK) ein schnell wachsendes Gebiet klinischer Untersuchungen für zellbasierte Therapien4.
Die ultrahohe Affinität von Antikörper-basierten Medikamenten, die Selektivität gegenüber Antigen-exemittierenden Tumorzellen bietet, macht es zu einem attraktiven Mittel. Ebenso ist die gezielte Abgabe und Tumorretention eines therapeutischen Antikörpers (oder eines chemischen Medikaments) der Schlüssel, um die Wirksamkeit über die Toxizität auszugleichen. Daher wird eine große Anzahl von Protein-Engineering-basierten Strategien, die, aber nicht beschränkt auf bispezifische5 und tri-spezifische Antikörper6 sind, genutzt, um die Avidität optimierte Tumorretention von intravenös (IV) injizierten Therapeutika5,7zu verbessern. Hier beschreiben wir eine einfache fluoreszenzbasierte Methode zur Behandlung der Tumor- und Gewebeverteilung potenziell wirksamer Krebsantikörper.
Da tierische Gewebe eine Autofluoreszenz besitzen, wenn sie im sichtbaren Spektrum angeregt werden, wurden die Antikörper zunächst mit einem nahen Infrarotfarbstoff (z. B. IRDye 800CW) gekennzeichnet. Für Proofs von Konzeptuntersuchungen haben wir Follatrezeptor alpha-1 (FOLR1) verwendet, der auf Antikörper namens Farletuzumab und dessen Derivat Namensbispecific Anker Cytotoxizitätsaktivator (BaCa)7 Antikörper abzielt, der FOLR1 und Todesrezeptor-5 (DR5)8 in einem rekombinanten Antikörper kotargets. FOLR1 ist ein klar definierter überexprimierter Zielrezeptor in Eierstock- und TNBC-Krebszellen, Tumor-Xenografts und Patiententumoren9. Bemerkenswert ist, dass es mehrere Bemühungen gibt, FOLR1 klinisch zu nutzen, indem Antikörper-basierte Ansätze verwendet werden, um Immuneffektorzellen und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC) für Eierstock- und Brustkrebs zu engagieren10,11.
In diesem Methodenpapier haben wir klinische samt Anti-FOLR1 (Farletuzumab) geklont, exprimiert und gereinigt. Als Negativkontrollen wurden der IgG1-Isotyp und ein klinischer Anti-Idiotyp Mucin-16-Antikörper namens Abagovomab12 verwendet. Nach der Protein-A-Reinigung wurden die angegebenen Antikörper mit IRDye 800CW gekennzeichnet und in die Schwanzvene von Nacktmäusen verabreicht, die entweder Eierstocktumor-Xenografts trugen oder stabil transfizierte menschliche FOLR1-Exzessen murinen Darmkrebs-Xenografts. Die Antikörperlokalisierung wurde durch Live-Bildgebung mit In-vivo-Bildgebungsspektrum an mehreren verschiedenen Zeitpunkten7verfolgt. Diese Methode erfordert keine genetische Veränderung oder Injektion des Substrats, um Lichtemission zu ermöglichen und ist deutlich schneller, kostengünstig und effizient. Das unten beschriebene allgemeine Klon-, Expressions-, Reinigungs- und Etikettierungsprotokoll kann auf jeden klinischen und nichtklinischen Antikörper angewendet werden, wenn schwere und leichte Kettensequenzen verfügbar sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektive und tumorgewebespezifische Abgabe von Anti-Krebs-Therapeutika ist der Schlüssel zur Messung der Wirksamkeit und Sicherheit einer bestimmten gezielten Therapie13. Hier haben wir einen schnellen und effizienten Ansatz beschrieben, um die detaillierte Gewebe- und Tumorverteilung von klinischem Farletuzumab und einem nichtklinischen BaCa-Antikörper zu untersuchen. Der beschriebene Ansatz ist auf jeden neu erzeugten Antikörper anwendbar und kann zusammen mit einem klinisch wirksamen Antik?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, der Biomolecular Analysis Facility, der Advanced Microscopy Facility und der Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S ist ein früher Karriere-Ermittler der Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Diese Arbeit wurde durch das NCI/NIH-Stipendium (R01CA233752) an J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) Breakthrough Level-1 Award an J. T-S (BC17097) und U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) Funding Award (OC180412) an J. T-S (BC17097) und U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S (BC17097) und U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S (BC17097) und Den U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S (BC17097) und den U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OC180412) an J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
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