Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo
Summary
Aquí presentamos un protocolo para estudiar la localización in vivo de anticuerpos en modelos de xenoinjertos tumorales en ratones.
Abstract
Los anticuerpos monoclonales son fármacos multifuncionales de alta afinidad que funcionan mediante mecanismos independientes variables para eliminar las células cancerosas. En las últimas décadas, el campo de los conjugados de anticuerpos y fármacos, anticuerpos biespecíficos, receptores de antígenos quiméricos (CAR) e inmunoterapia contra el cáncer ha surgido como el área más prometedora de las investigaciones básicas y terapéuticas. Con numerosos ensayos en humanos exitosos dirigidos a receptores de punto de control inmune y células CAR-T en leucemia y melanoma a un ritmo revolucionario, es muy emocionante para las terapias oncológicas derivadas de variaciones de la ingeniería de anticuerpos. Lamentablemente, un número significativamente grande de anticuerpos y terapias basadas en CAR también han demostrado ser decepcionantes en los ensayos en humanos de cánceres sólidos debido a la limitada disponibilidad de células de efector inmune en el lecho tumoral. Es importante destacar que la distribución inespecífica de anticuerpos terapéuticos en tejidos distintos de los tumores también contribuye a la falta de eficacia clínica, toxicidad asociada e insuficiencia clínica. Como la traducción fiel de estudios preclínicos en senderos clínicos en humanos se basa en gran medida en los estudios de eficacia y seguridad del xenoinjerto tumoral de ratones, aquí destacamos un método para probar el tumor y la distribución general del tejido de los anticuerpos terapéuticos. Esto se logra mediante la etiqueta del anticuerpo purificado de proteína A con un tinte fluorescente infrarrojo cercano seguido de imágenes en vivo de ratones portadores de tumores.
Introduction
Fda aprobó el primer anticuerpo monoclonal dirigido a CD3 (OKT3, Muromonab) en 19861,2. Desde entonces durante los siguientes veinte años, ha habido una rápida explosión en el campo de la ingeniería de anticuerpos debido al éxito abrumador de los anticuerpos contra los inhibidores del punto de control inmune3. Además de la activación indirecta del sistema inmunitario, los anticuerpos están destinados a marcar directamente las células cancerosas para atacar con precisión las células del efector inmune, desencadenar la citotoxicidad a través del agonista del receptor de la muerte, bloquear la señalización de supervivencia de las células tumorales, obstruir la angiogénesis (crecimiento de los vasos sanguíneos), restringir los reguladores del punto de control inmune, entregar radioisótopos, medicamentos de quimioterapia y siRNA como agentes conjugados2. Además, el estudio de los fragmentos variables de cadena única (scFv) de varios anticuerpos en la superficie de células T y células NK derivadas del paciente (CAR-T y CAR-NK) es un área de rápido crecimiento de las investigaciones clínicas para terapias basadas en células4.
La afinidad ultra alta de los fármacos basados en anticuerpos que proporciona selectividad a los antígenos que expresan las células tumorales lo convierten en un agente atractivo. Del mismo modo, la administración dirigida y la retención tumoral de un anticuerpo terapéutico (o un fármaco químico) es la clave para equilibrar la eficacia sobre la toxicidad. Por lo tanto, un gran número de estrategias basadas en la ingeniería de proteínas que incluyen pero no se limitan a biespecíficos5 y anticuerpos tri-específicos6 están siendo explotados para mejorar significativamente la avidez optimizada de la retención tumoral de la terapia inyectada por vía intravenosa (IV)5,7. Aquí, describimos un método simple basado en la fluorescencia para abordar la distribución del tumor y el tejido de anticuerpos contra el cáncer potencialmente eficaces.
Debido a que los tejidos animales poseen autofluorescencia cuando se excitan en el espectro visible, los anticuerpos fueron inicialmente etiquetados con un tinte infrarrojo cercano (por ejemplo, IRDye 800CW). Para las pruebas de investigaciones conceptuales, hemos hecho uso del receptor de folato alfa-1 (FOLR1) dirigido a anticuerpos llamados farletuzumab y su derivado llamado activador de citotoxicidad de anclaje biespecí (BaCa)7 anticuerpo que se dirige a FOLR1 y receptor de muerte-5 (DR5)8 en un anticuerpo recombinante. FOLR1 es un receptor diana sobreexpresado bien definido en células cancerosas de ovario y TNBC, xenoinjertos tumorales y tumores de pacientes9. En particular, existen múltiples esfuerzos para explotar clínicamente FOLR1 utilizando enfoques basados en anticuerpos para involucrar células efectos inmunes y conjugados de fármacos de anticuerpos (ADC) para cánceres de ovario y de mama10,11.
En este documento de métodos, clonamos, expresamos y purificamos anti-FOLR1 clínicos (farletuzumab) junto con otros anticuerpos de control utilizando el sistema de expresión CHO. El isotipo IgG1 y un anticuerpo clínico anti-idiotipo mucina-16 llamado abagovomab12 se utilizaron como controles negativos. Tras la purificación de proteínaS A, los anticuerpos indicados se etiquetaron con IRDye 800CW y se administraron en la vena de la cola de ratones desnudos que tenían xenoinjertos tumorales de ovario o se trans infectaron establemente FOLR1 humano que expresan xenoinjertos de cáncer de colon murino. La localización de anticuerpos fue rastreada por imágenes en vivo utilizando espectro de imágenes in vivo en múltiples puntos de tiempo diferentes7. Este método no requiere ninguna modificación genética o inyección del sustrato para permitir la emisión de luz y es significativamente más rápido, rentable y eficiente. El protocolo general de clonación, expresión, purificación y etiquetado descrito a continuación se puede aplicar a cualquier anticuerpo clínico y no clínico si hay secuencias de cadena pesadas y ligeras disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
La administración selectiva y específica del tejido tumoral del agente terapéutico contra el cáncer es la clave para medir la eficacia y la seguridad de una terapia dirigida determinada13. Aquí hemos descrito un enfoque rápido y eficiente para investigar la distribución detallada del tejido y tumoral de la clínica, farletuzumab y un anticuerpo BaCa no clínico. El enfoque descrito es aplicable a cualquier anticuerpo recién generado y se puede utilizar junto con un anticuerpo clínicamente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a la instalación de imágenes principales del Centro Oncológico de la Universidad de Virginia, a la Instalación de Análisis Biomolecular, a la Instalación de Microscopía Avanzada y a la Instalación Core Vivarium para asistencia. J. T-S es un investigador de carrera temprana de la Academia de Cáncer de Ovario (OCA-DoD). Este trabajo fue apoyado por la subvención NCI/NIH (R01CA233752) a J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) premio de nivel 1 de gran avance a J. T-S (BC17097) y U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) premio de financiación (OC180412) a J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
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