Метод совместной культуры для изучения Нейрита Отток аурост в ответ на стоматологические целлюлозы Паракриновые сигналы
Summary
Мы описываем изоляцию, дисперсию и покрытие зубной пульпы (DP) первичных клеток с тройничных (TG) нейронов культивируется на вершине над трансвелл фильтры. Клеточные реакции клеток ДП можно анализировать с помощью иммунофлюоресценции или АНАЛИЗА РНК/белка. Иммунофлуоресценция нейронных маркеров с конфокальной микроскопией позволяет анализировать реакции невритовых наростов.
Abstract
Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Без сенсорной иннервации ежедневная пероральная деятельность нанесет непоправимый ущерб. Несмотря на свою важность, роль иннервации в развитии и обслуживании зубов в значительной степени упускается из виду. Несколько исследований показали, что DP-клетки выделяют внеклеточные матричные белки и паракриновые сигналы для привлечения и руководства Аксонами TG в и по всему зубу. Тем не менее, несколько исследований предоставили детальное представление о перекрестном разговоре между мезенхимом DP и нейрональными афферентами. Для устранения этого пробела в знаниях исследователи начали использовать сокультуры и различные методы для изучения этих взаимодействий. Здесь мы демонстрируем несколько шагов, участвующих в сокультивации первичных клеток ДП с TG нейронов рассеялись на надивной трансвелл фильтр с большим диаметром поры, чтобы аксональный рост через поры. Первичные клетки DP с геном интереса в окружении локс сайтов были использованы для облегчения удаления генов с помощью аденовирусной-Cre-GFP рекомбиназной системы. Использование TG нейронов из мыши Thy1-YFP позволило точное афферентное изображение, с выражением значительно выше фоновых уровней конфокальной микроскопии. Ответы DP могут быть исследованы с помощью сбора и анализа белков или РНК, или же, через иммунофлуоресцентное окрашивание клеток ДП, покрытых съемными стеклянными крышками. Средства массовой информации могут быть проанализированы с помощью таких методов, как протеомный анализ, хотя это потребует истощения альбумина из-за присутствия сыворотки крупного рогатого скота в средствах массовой информации. Этот протокол предоставляет простой метод, которым можно манипулировать для изучения морфологических, генетических и цитоскелетных реакций TG нейронов и клеток ДП в ответ на контролируемую среду совместного культурного исследования.
Introduction
Иннервация зубов позволяет зубам чувствовать давление, температуру и воспаление, все из которых имеют решающее значение для использования и поддержания зубного органа. Неспособность почувствовать боль зубов, связанную с кариесом зубов и травмой, приводит к прогрессированию заболевания. Таким образом, надлежащая иннервация является требованием для нормального роста зубов, функции и ухода.
В то время как большинство органов полностью функциональны и invated к моменту рождения, развитие зубов распространяется на взрослую жизнь, с иннервации зубов и минерализации, происходящих в концерте во время послеродовой стадии1,2. Интересно, что зубная целлюлоза (DP) мезенхим первоначально выделяет репелленты сигналы во время эмбриогенеза, чтобы предотвратить проникновение аксона в развивающийся зубной орган, который позже переходит к секреции привлекательных факторов, как зуб приближается к извержению3,4. Во время послеродовых стадий афферентные аксоны из тройничного (TG) нерва проникают в и по всему зубу во время осаждения дентина начинается (обзор в Pagella, P. et al.5). Несколько исследований in vivo показали, что нейронно-мезенхимальные взаимодействия направляют иннервацию зубов у мышей (рассмотрено в Luukko, K. et al.6),но мало деталей молекулярных механизмов доступны.
Сокультуры клеток обеспечивают контролируемую среду, в которой исследователи могут манипулировать взаимодействиями между нейронными и мезенхимальными популяциями. Эксперименты по совместной культуре позволяют глубже углубиться в сигнальные пути, направляющие иннервацию и развитие зубов. Тем не менее, некоторые из обычных методов, используемых для изучения клеток в совместной культуре представляют технические проблемы. Например, кристально фиолетовое окрашивание невритовых наростов может неспецифически пятно Шванн клетки, включенные в TG рассеивания рассеивания расслоения расслоения, и могут быть пики интенсивности цвета с относительно небольшими ответами7. Микрофлюидные камеры предлагают привлекательный вариант, но значительно дороже, чем трансвелл фильтры8,9 и только позволяют исследования нейрональных реакций на DP выделения. Для решения этих вопросов, мы разработали протокол, который позволяет: а) точное окрашивание и изображение TG неврит рост в ответ на DP выделения, б) генетическая модификация DP клеток и / или TG нейронов для расследования конкретных сигнальных путей, и в) исследование DP клеток ответы на факторы, выделяемые TG нейронов. Этот протокол обеспечивает возможность точно исследовать несколько особенностей иннервации зубов в контролируемой среде анализа совместной культуры in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ежедневная деятельность полости рта требует, чтобы зубы смысле внешних стимулов и внутреннего воспаления, с тем чтобы обеспечить надлежащее использование и техническое обслуживание. Однако, только ограниченная информация имеющаяся относительно сигналов которые управляют процессам?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана а) Национальные институты здравоохранения / NIAMS (грант номера R01 AR062507 и R01 AR053860 в RS), б) Университет Алабамы в Бирмингеме Стоматологическая академическая исследовательская подготовка (DART) грант (номер T90DE022736 (PI MacDougall)) в SBP от Национального института стоматологических и краниоциальных исследований / национального института в) UAB Глобальный центр краниофациальных, устных и стоматологических расстройств (GC-CODED) Пилот и доступность гранта SBP и d) Национальный институт стоматологии и craniofacial Научно-исследовательские/Национальные институты здравоохранения K99 DE024406 грант SBP.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. 神经科学. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. 神经科学. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
