Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi
Summary
Biz izolasyon, dağılım ve diş hamuru kaplama (DP) trigeminal ile birincil hücrelerin kaplama (TG) nöronlar üstteki transwell filtreleri üzerinde kültürlü. DP hücrelerinin hücresel yanıtları immünofloresan veya RNA/protein analizi ile analiz edilebilir. Konfokal mikroskopi ile nöronal belirteçlerin immünfloresansi neurite outgrowth yanıtlarının analizine izin verir.
Abstract
Diş innervasyonu dişlerin basınç, sıcaklık ve iltihabı algılamasını sağlar, bunların hepsi diş organının kullanımı ve bakımı için çok önemlidir. Duyusal innervasyon olmadan, günlük oral aktiviteler onarılamaz hasara neden olur. Önemine rağmen, diş geliştirme ve bakım innervasyon rolleri büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Çeşitli çalışmalar DP hücrelerinin dişe ve diş boyunca TG aksonları çekmek ve yönlendirmek için hücre dışı matriks proteinleri ve parakrin sinyalleri salgıladığını göstermiştir. Ancak, birkaç çalışma DP mezenchyme ve nöronal afferents arasındaki çapraz konuşma içine ayrıntılı bir fikir sağlamıştır. Bilgideki bu boşluğu gidermek için araştırmacılar bu etkileşimleri araştırmak için ortak kültürleri ve çeşitli tekniklerden yararlanmaya başladılar. Burada, gözenekleri aracılığıyla aksonal büyüme sağlamak için büyük çaplı gözenekleri ile bir üstteki transwell filtre üzerinde dağınık TG nöronlar ile co-culturing birincil DP hücreleri dahil birden fazla adım göstermektedir. Adenovirüs-Cre-GFP rekombinaz sistemi kullanılarak gen delesini kolaylaştırmak için loxP bölgelerinin oluşturduğu ilgi genine sahip primer DP hücreleri kullanılmıştır. Thy1-YFP fareden TG nöronlar kullanarak hassas afferent görüntüleme için izin, konfokal mikroskopi ile arka plan seviyelerinin çok üzerinde ifade ile. DP yanıtları protein veya RNA toplama ve analizi yoluyla veya alternatif olarak çıkarılabilir cam kapaklar üzerine kaplanmış DP hücrelerinin immünofloresan boyama yoluyla araştırılabilir. Medya proteomik analizler gibi teknikler kullanılarak analiz edilebilir, ancak bu medyada fetal sığır serumunun varlığından dolayı albümin tükenmesini gerektirir. Bu protokol, tg nöronlarının ve DP hücrelerinin morfolojik, genetik ve sitosiskeleter yanıtlarını incelemek için manipüle edilebilen basit bir yöntem sağlar.
Introduction
Diş innervasyonu dişlerin basınç, sıcaklık ve iltihabı algılamasını sağlar, bunların hepsi diş organının kullanımı ve bakımı için çok önemlidir. Diş çürükleri ve travma ile ilişkili diş ağrısı hissedilmemesi hastalığın ilerlemesine yol açar. Böylece, uygun innervasyon normal diş büyümesi, fonksiyon ve bakım için bir gerekliliktir.
Çoğu organ tamamen işlevsel ve doğum zamanı ile innerve iken, diş gelişimi yetişkin yaşam içine uzanır, diş innervasyonu ve mineralizasyon sonrası aşamalarında meydana gelen ile1,2. İlginçtir, diş hamuru (DP) mezenchyme başlangıçta gelişmekte olan diş organıiçine akson girişini önlemek için embriyogenez sırasında itici sinyalleri salgılar, hangi daha sonra diş patlaması yakın olarak çekici faktörlerin salgısına geçer3,4. Doğum sonrası evrelerde, trigeminal (TG) sinirinden gelen afferent aksonlar, dentin birikiminin başladığı zaman dişin içine ve her zamanına nüfuz eder (Pagella, P. ve ark.5’tegözden geçirilir). Vivo çalışmalarda çeşitli nöronal-mezenkimal etkileşimler farelerde diş innervasyonu kılavuzu göstermiştir (Luukko gözden, K. veark. 6),ama moleküler mekanizmaların birkaç ayrıntı mevcuttur.
Hücre ortak kültürleri, araştırmacıların nöronal ve mezenkimal popülasyonlar arasındaki etkileşimleri manipüle edebildiği kontrollü ortamlar sağlar. Ortak kültür deneyleri, diş innervasyonu ve gelişimine rehberlik eden sinyal yollarının daha derinlerine dalmamayı mümkün kılar. Ancak, ortak kültürdeki hücreleri incelemek için kullanılan geleneksel yöntemlerin bir çoğu teknik zorluklar sunmaktadır. Örneğin, neurite büyüme kristal mor boyama non-özel TG demet dağılımları dahil Schwann hücreleri leke olabilir, ve nispeten küçük tepkiler ile renk yoğunluğu zirveleri olabilir7. Mikroakışkan odaları cazip bir seçenek sunuyoruz, ancak transwellfiltreler 8,9 ve sadece DP salgıları nöronal tepkilerin araştırılmasına izin çok daha pahalıdır. Bu sorunları ele almak için, bir protokol geliştirdik: a) DP salgılarına yanıt olarak TG neurite outgrowth kesin boyama ve görüntüleme, b) DP hücreleri ve / veya TG nöronlar genetik modifikasyonbelirli sinyal yollarını araştırmak için, ve c) TG nöronlar tarafından salgılanan faktörlere DP hücre yanıtlarının araştırılması. Bu protokol, bir in vitro co-kültür testin kontrollü ortamında diş innervasyonunun çeşitli özelliklerini tam olarak araştırma olanağı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ağız boşluğugünlük faaliyetleri dişlerin uygun kullanım ve bakım izin vermek için dış uyaranları ve iç iltihabı algılamak gerektirir. Ancak, diş innervasyonunun gelişim süreçlerini yönlendiren sinyallerle ilgili sadece sınırlı bilgi mevcuttur. Bu protokol, iki popülasyon arasındaki çapraz iletişimi incelemek için birincil DP hücrelerini ve TG nöronlarını izole etmek ve birlikte kültüre getirmek için bir yöntem sağlar. Çeşitli değişkenler optimize edildi ve aşağıda açıklandı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma a) Ulusal Sağlık Enstitüleri/NIAMS (rs’ye R01 AR062507 ve R01 AR053860, b) Alabama Üniversitesi Birmingham Diş Akademik Araştırma Eğitimi (DART) hibe (sayı T90DE022736 (PI MacDougall)) tarafından Desteklenmiştir. c) Bir UAB Küresel Merkezi Kraniyofasiyal, Ağız ve Diş Bozuklukları (GC-KODLU) Pilot ve Fizibilite hibe SBP ve d) Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Enstitüsü Araştırma / Ulusal Sağlık Enstitüleri K99 DE024406 SBP hibe.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. 神经科学. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. 神经科学. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
