שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים
Summary
אנו מתארים את הבידוד, פיזור וציפוי של התאים הראשוניים של שיניים (DP) בתאי הראשי עם מסננים (TG) נוירונים תרבותי על גבי מסנני transwell יטב. התגובות הסלולר של תאים DP ניתן לנתח עם immunofluorescence או בניתוח RNA/חלבון. אימונואופלונציה של סמנים עצביים עם מיקרוסקופ קונפוקלית מאפשר ניתוח של תגובות neurite מוצלח.
Abstract
אינבציה שן מאפשר לשיניים לחוש לחץ, טמפרטורה ודלקת, כולם חיוניים לשימוש ותחזוקה של איבר השן. ללא שימור חושי, פעילות שבעל פה יומית. תגרום נזק בלתי הפיך למרות חשיבותו, תפקידי האינבציה בהתפתחות השן ותחזוקתו התעלמו במידה רבה. מספר מחקרים הוכיחו כי תאים DP להפריש חלבונים מטריקס מטריצות ואותות הפרדרין כדי למשוך ולהנחות TG אקסונים לתוך ולאורך השן. עם זאת, מחקרים מעטים סיפקו תובנה מפורטת לתוך הטבלת הצלבות בין מספר העקורים לבין האפיפראנטים העצביים. כדי לטפל בפער זה בידע, החוקרים החלו לנצל שיתוף תרבויות ומגוון של טכניקות כדי לחקור את האינטראקציות האלה. כאן, אנו להדגים את השלבים מרובים מעורבים בתאי DP הראשי של העקורים עם הנוירונים TG התפזרו על מסנן מעבר היטב עם נקבוביות בקוטר גדול כדי לאפשר צמיחה סיבי דרך הנקבוביות. בתאי DP העיקרי עם הגן של הריבית מוקף האתרים loxP היו מנוצלים כדי להקל על מחיקת גנים באמצעות אדנווירוס-recombinase GFP מערכת. שימוש בנוירונים TG מהעכבר Thy1-yfp מותר לדימות מדויק של כלי לימפה, עם ביטוי היטב מעל רמות הרקע על ידי המיקרוסקופיה. תגובות DP ניתן לחקור באמצעות חלבון או או RNA איסוף וניתוח, או לחילופין, באמצעות כתמים immunofluorescent של תאים DP מצופה על כיסוי זכוכית נשלפת. מדיה ניתן לנתח באמצעות טכניקות כגון ניתוח פרוטאומית, למרות זה ידרוש המחסור אלבומין בשל נוכחותם של סרום העוברי העובר במדיה. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה שיכולה להיות מניפולציות כדי ללמוד את התגובות מורפולוגית, גנטית, השלד ואת התשובות של הנוירונים TG ותאי DP בתגובה לסביבה מבוקרת של שיתוף תרבות שיטת.
Introduction
אינבציה שן מאפשר לשיניים לחוש לחץ, טמפרטורה ודלקת, כולם חיוניים לשימוש ותחזוקה של איבר השן. אי תחושה של כאב שיניים הקשורים עששת וטראומה מוביל התקדמות המחלה. לכן, אינבציה נכונה היא דרישה לצמיחה שן רגילה, תפקוד וטיפול.
בעוד רוב האיברים הם פונקציונליים לחלוטין innervated על ידי זמן הלידה, התפתחות שיניים מרחיב לחיי מבוגרים, עם אינבציה שן ומינרליזציה המתרחשים בקונצרט במהלך השלבים לידה1,2. באופן מעניין, עיסת שיניים (DP) מזנכימה בתחילה מפריש אותות דוחה במהלך embryogenesis כדי למנוע כניסה אקסון לתוך האיבר המתפתח השיניים, אשר מאוחר יותר משתנה הפרשה של גורמים מושכים כמו השן התקרבות התפרצות3,4. במהלך השלבים לאחר הלידה, כלי לימפה אקסונים מתוך העצבים המשולש (TG) לחדור לתוך ולאורך השן סביב הזמן דנטט התצהיר מתחיל (נבדקו pagella, P. et al.5). מספר מחקרים vivo הוכיחו כי התקשורת העצבית-mesenchymal מדריך שיניים מורה בעכברים (נבדקו ב Luukko, K. et al.6), אבל כמה פרטים של מנגנונים מולקולריים זמינים.
שיתוף התרבויות הסלולארי מספק סביבות מבוקרות שבהן החוקרים יכולים להשפיע על האינטראקציות בין אוכלוסיות נירואליות לבין אוכלוסיית מסנצ’יאל. שיתוף האמנות ניסויים לאפשר להתעמק עמוק יותר לתוך משעולים איתות המנחה השן ופיתוח. עם זאת, כמה מהשיטות הקונבנציונליות המשמשות לחקר התאים בתרבות המשותף מציגים אתגרים טכניים. למשל, כתמים קריסטל סגול של neurite מוצלח יכול לא במיוחד הכתמים שתאי schwann כלולים בדיסיות הצרור TG, וייתכנו פסגות בחוזק צבע עם תגובות קטנות יחסית7. חדרי מיקרופלואידיג מציעים אופציה אטרקטיבית, אבל הם הרבה יותר יקרים מאשר מסנני העברה של8,9 ורק לאפשר את החקירה של תגובות נוירואליות הפרשות העקורים. כדי לטפל בנושאים אלה, פיתחנו פרוטוקול המאפשר: a) כתמים מדויקים והדמיה של TG neurite מוצלח בתגובה הפרשות DP, b) שינוי גנטי של תאים dp ו/או הנוירונים TG לחקור מסלולים מסוימים איתות, ו c) חקירה של תגובות תא DP הגורמים מופרש על ידי TG נוירונים. פרוטוקול זה מספק את היכולת לחקור במדויק מספר תכונות של אינבציה שן בסביבה מבוקרת של שיתוף תרבות חוץ-גופית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפעילויות היומיומיות של חלל הפה דורשים כי תחושת השיניים גירויים חיצוניים דלקת פנימית על מנת לאפשר שימוש נאות ותחזוקה. עם זאת, רק מידע מוגבל זמין לגבי האותות הנוהגים בתהליכים ההתפתחותיים של השימור השן. פרוטוקול זה מספק שיטה לבידוד ושיתוף של התאים העיקריים של DP ו-TG הנוירונים כדי ללמוד את הת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי) המוסדות הלאומיים לבריאות/NIAMS (להעניק מספרים R01 AR062507 ו R01 AR053860 ל RS), ב) אוניברסיטת אלבמה הדרכה המחקר האקדמי של ברמינגהאם (DART) מענק (מספר T90DE022736 (PI MacDougall) כדי SBP מן המכון הלאומי לרפואת שיניים, מכוני בריאות הלאומי, ג) מרכז עולמי UAB עבור הגולגולת, אוראלי הפרעות שיניים (GC-מקודד) פיילוט והיתכנות מענק SBP ו-d) המכון הלאומי לרפואת שיניים וקרניו Ofacial מחקר/מכוני לאומי של בריאות K99 DE024406 מענק SBP.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. 神经科学. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. 神经科学. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
