Summary

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Published: March 13, 2020
doi:

Summary

שיטה לניתוח בלתי ממוקד של מטבוליטים דגן חיטה ושומנים מוצג. הפרוטוקול כולל שיטת הפקת מטבוליט מטבוליזם והיפוך נוזל בשלב כרומטוגרפיה מתודולוגיה להמסת המסה, עם רכישת מצבי מגנטי חיובי ושלילי.

Abstract

הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה והניהול בפרקטיקה החקלאית עלולה לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. הנתונים הטבולומיקס מספקים הקראה מתוך האינטראקציות הללו ברגע נתון והיא אינפורמטיבית של הסטטוס הביוכימי של האורגניזם. עוד, מטבוליטים בודדים או פאנלים של מטבוליטים ניתן להשתמש כמו סמנים מדויקים עבור תשואה וחיזוי איכות וניהול. הצמח מטביו צפוי להכיל אלפי מולקולות קטנות עם תכונות פיזיקליות מגוונות המספקים הזדמנות התובנה הביוכימי לתוך תכונות פיסיולוגיים גילוי ביואריקר. כדי לנצל את זה, מטרת המפתח עבור החוקרים טבולומיקס היא ללכוד כמה שיותר מגוון פיזיקליים ככל האפשר בתוך ניתוח אחד. כאן אנו מציגים שיטה טבולומיקס מבוססת על בסיס כרומטוגרפיה, מבוסס על מטרה בלתי ממוקדת לניתוח דגן חיטה מצמח. השיטה משתמשת במנהל הממס של הנוזל chromatograph הנוזלי כדי להציג שלב נייד שלישי ומשלבת מעבר מסורתי שלב היפוך עם מעבר שומנים בהדרגה. הכנת תבואה, הפקת מטבוליזם, ניתוח אינסטרומנטלי וזרימות עבודה של עיבוד נתונים מתוארות בפרוטרוט. דיוק המוני והאותות הטובים נצפו והשיטה הניבה כ-500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל מצב יינון. יתר על כן, המטלוליט שונים באופן משמעותי ואותות תכונה שומנים בין זני חיטה נקבעו.

Introduction

הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה ונוהלי הניהול בחקלאות עלולים לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. מטבוליטים צמחיים מושפעים גורמים כגון הגנום, הסביבה (אקלים, כמות המשקעים וכו ‘), ובסביבה החקלאות, הדרך יבולים מנוהלים (כלומר, יישום של דשן, קוטלי פטריות וכו ‘). בניגוד הגנום, מטאבולזה מושפע כל הגורמים האלה ולכן טבולומיקס נתונים מספק טביעת אצבע ביוכימית של אינטראקציות אלה בזמן מסוים. יש בדרך כלל אחת משתי המטרות למחקר מבוסס טבולומיקס: ראשית, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של ביוכימיה של האורגניזם ולעזור להסביר את מנגנון התגובה הפרטורציה (abiotic או לחץ ביוטי) ביחס הפיזיולוגיה; ושנית, לחבר בסמנים עם הפרטורציה תחת לימוד. בשני המקרים, התוצאה של הידע הזה היא אסטרטגית ניהול מדויקת יותר כדי להשיג את המטרה של גודל תשואה משופרת ואיכות.

הצמח בתוך המפעל צפוי להכיל אלפי1 של מולקולות קטנות עם תכונות פיסיוכימיקלים מגוונים. כיום, אין פלטפורמות טבולומיקס (בעיקר ספקטרומטר מסה וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית) יכולים ללכוד את המטה כולו בניתוח אחד. פיתוח טכניקות כאלה (הכנה לדוגמה, הפקת מטבוליזם וניתוח), אשר מספקים כיסוי גדול של מטאמיטין ככל האפשר בתוך הפעלה אנליטית אחת, היא מטרה מרכזית עבור חוקרים טבולומיקס. ניתוח טבולומיקס הקודם לא ממוקד של דגנים חיטה יש נתונים משולבים הפרדות כרומטוגרפיות מרובות ומכשור הרכישה ו/או מיכשור עבור כיסוי מטאמיאלי גדול יותר. עם זאת, יש צורך בדוגמאות שניתן להכין ולרכוש בנפרד עבור כל מודאליות. לדוגמה, Beleggia ואח ‘2 הכין דוגמה ללעג עבור ניתוח GC-ms של אנליטים קוטביים בנוסף לניתוח GC-ms של האנליטים הלא קוטבי. Das et al.3 בשימוש הן GC-ו-LC-MS שיטות כדי לשפר את הכיסוי בניתוח שלהם; עם זאת, גישה זו דורשת בדרך כלל הכנות לדוגמה נפרדת כמתואר לעיל וכן שתי פלטפורמות אנליטיות עצמאיות. ניתוחים קודמים של דגנים חיטה באמצעות GC-ms2,3,4 ו-LC-ms3,5 פלטפורמות הניבו 50 כדי 412 (55 זיהה) תכונות עבור gc-ms, 409 עבור משולב gc-ms ו-LC-ms וכמה אלפי עבור ניתוח LC-ms lipidomics5. על-ידי שילוב לפחות שני מצבים לניתוח אחד, ניתן לשמור על הכיסוי המוארך באופן מתקדם, ולהגדיל את עושרה של פרשנות ביולוגית תוך הנחה גם חיסכון בזמן ובעלות.

כדי לאפשר את ההפרדה היעילה של מגוון רחב של מינים שומנים בדם על ידי כרומטוגרפיה בשלב הפוך, lipidomics המודרנית מתודולוגיות בדרך כלל להשתמש בחלק גבוה של איזופנול ממיסים6, מתן שיעורי השומנים לכיתות שעשויות להיות לא פתורות על ידי הכרומטוגרפיה. עבור הפרדה יעילה השומנים, השלב ההתחלתי הנייד הוא גם הרבה יותר גבוה בהרכב אורגני7 מאשר שיטות היפוך אופייני כרומטוגרפי שלב, אשר לשקול מחלקות אחרות של מולקולות. ההרכב האורגני הגבוה בתחילת מעבר הצבע הופך את השיטות הללו למתאימות פחות למחלקות רבות אחרות של מולקולות. בעיקר, בשלב הפוך כרומטוגרפיה נוזלי מעסיקה מעבר מומס בינארי, החל בהרכב מימית בעיקר והגדלת תוכן אורגני כמו חוזק הכרומטוקציה של הכרומטוגרפיה גדל. לשם כך, ביקשו לשלב את שתי הגישות כדי להשיג הפרדה של שיעורי השומנים וגם לא ליפיד של מטבוליטים בתוך ניתוח אחד.

כאן, אנו מציגים שיטת כרומטוגרפית המשתמשת בשלב הנייד השלישי ומאפשרת שלב היפוך מסורתי משולב וlipidomics-שיטת כרומטוגרפיה מתאימה באמצעות הכנה לדוגמה אחת וטור אנליטי אחד. אימצנו רבות מאמצעי בקרת איכות ושלבי סינון נתונים שיושמו בעבר במחקרים טבולומיקס קליניים בעיקר. גישות אלה שימושיות בקביעת תכונות איתנות עם שימוש ביכולות טכניות גבוהות ורלוונטיות ביולוגית וכוללת את אלה שאינם עומדים בקריטריונים אלה. לדוגמה, אנו מתארים ניתוח חוזר של מדגם qc במאגר8, תיקון QC9, סינון נתונים9,10 והשלכה של תכונות חסרות11.

Protocol

שיטה זו מתאימה ל -30 דגימות (כ-150 זרעים לכל מדגם). במקום שימשו כאן שימוש בשלושה משכפל ביולוגי של עשרה סוגי חיטה שונים. 1. הכנת גרגירים לאחזר דגימות (דגנים מלאים) מ-80 ° c אחסון.הערה: ייבוש זרעים מומלץ זמן קצר לאחר הקטיף אם מדגמים נאספים ממספר עונות. זה ממזער את כל השינויים ברי…

Representative Results

המפעל מושפע משילוב של הגנום והסביבה שלה, ובנוסף בסביבה חקלאית, משטר ניהול יבול. אנו מדגימים כי הבדלים גנטיים בין זני חיטה ניתן לצפות ברמת מטבוליט, כאן, עם מעל 500 תרכובות נמדד מראה ריכוזים שונים באופן משמעותי בין זנים בלבד בדגן. דיוק המוני טוב (< 10 דפים לדקה שגיאה) ו האות מובח?…

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטת LC-MS מבוסס טבולומיקס שאינה ממוקדת ניתוח של דגן חיטה. השיטה משלבת ארבעה מצבי רכישה (שלב הפוך ושלב הפוך לשומנים עם אינון חיובי ושלילי) לשני מצבים על ידי החדרת שלב נייד שלישי לתוך הדרגתי שלב היפוך. הגישה המשולבת הניבה כ 500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל קוטביות יון עם כמחצית ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר בתוכנית החקלאות ומלגת המזון של מערב אוסטרליה (המחלקה למשרות, תיירות, מדע וחדשנות, ממשלת אוסטרליה המערבית) וברנש של ראש הממשלה, פרופסור סיימון קוק (המרכז ל החקלאות הדיגיטלית, אוניברסיטת קורטין ואוניברסיטת מרדוק). ניסויים שדה ואוסף לדוגמה דגנים תמכו על ידי הממשלה של התוכנית תמלוגים של אוסטרליה מערב האזורים. אנו מכירים בגראנטלי סטיינר ורוברט פרנץ ‘ בגין תרומתם לניסויי שדה. הביו-טפסים של אוסטרליה. מודה במימון הציוד

Materials

13C6-sorbitol Merck Sigma-Aldrich 605514
2-aminoanthracene Merck Sigma-Aldrich A38800-1 g
Acetonitrile ThermoFisher Scientific FSBA955-4 Optima LC-MS grade
Ammonium formate Merck Sigma-Aldrich 516961-100 mL >99.995%
Analyst TF Sciex Version 1.7
AnalyzerPro software SpectralWorks Ltd. Data processing software used for step 7.2. Version 5.7
AnalyzerPro XD sortware SpectralWorks Ltd. Data processing software used for step 7.5. Version 1.4
Balance Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.
d6-transcinnamic acid Isotec 513962-250 mg
Formic acid Ajax Finechem Pty. Ltd. A2471-500 mL 99%
Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) Labconco 7670031
Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)
Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) Velocity Scientific Solutions VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)
Installation kit for Sciex TripleToF Sciex p/n 4456736
Isopropanol ThermoFisher Scientific FSBA464-4 Optima LC-MS grade
Laboratory blender Waring commercial Model HGBTWTS3
Leucine-enkephalin Waters p/n 700008842 Tuning solution
Metaboanalyst https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.
Methanol ThermoFisher Scientific FSBA456-4 Optima LC-MS grade
Miconazole Merck Sigma-Aldrich M3512-1 g
Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) 5426 No. 0021716
Microcentrifuge tubes (2 mL) SSIbio 1310-S0
Microsoft Office Excel Microsoft
Peak View software Sciex Version 1.2 (64-bit)
Pipette tips (200 uL, 100 uL) ThermoFisher Scientific MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)
Pipettes (200 uL, 1000 uL) ThermoFisher Scientific
Plastic centrifuge tubes (15 mL) ThermoFisher Scientific NUN339650
Progenesis QI Nonlinear Dynamics Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)
Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer Sciex
Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads Bertin Technologies
Sodium formate Merck Sigma-Aldrich 456020-25 g
Tissue lyser/homogeniser Bertin Technologies Serial 0001620
Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)
Vortex mixer IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) 001722
Water ThermoFisher Scientific FSBW6-4 Optima LC-MS grade
Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps Waters
Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column Waters p/n 186005614

References

  1. Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
  2. Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
  3. Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
  4. Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
  5. Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
  6. Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
  7. Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
  8. Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
  9. Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
  10. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
  11. Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
  12. Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
  13. Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
  14. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  15. Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).

Play Video

Cite This Article
Abbiss, H., Gummer, J. P. A., Francki, M., Trengove, R. D. Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain. J. Vis. Exp. (157), e60851, doi:10.3791/60851 (2020).

View Video