Summary

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Published: March 13, 2020
doi:

Summary

Apresenta-se um método para a análise não direcionada de metabólitos e lipídios de grãos de trigo. O protocolo inclui um método de extração metabólica acetonitrila e metodologia de espectrometria de cromatografia líquida de fase invertida, com aquisição em modos positivos e negativos de ionização eletrospray.

Abstract

Compreender as interações entre genes, meio ambiente e gestão na prática agrícola poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e qualidade do produto. Os dados metabolômicos fornecem uma leitura dessas interações em um dado momento e são informativos do estado bioquímico de um organismo. Além disso, metabólitos individuais ou painéis de metabólitos podem ser usados como biomarcadores precisos para previsão e gerenciamento de rendimento e qualidade. Prevê-se que o metabolome da planta contenha milhares de pequenas moléculas com variadas propriedades físico-químicas que fornecem uma oportunidade para uma visão bioquímica sobre traços fisiológicos e descoberta de biomarcadores. Para explorar isso, um objetivo fundamental para os pesquisadores de metabolômica é capturar o máximo possível da diversidade físico-química em uma única análise. Aqui apresentamos um método de metabolômica de massa de cromatografia líquida à base de espectrometria para a análise de grãos de trigo cultivados em campo. O método usa o gerenciador de solventes quaternários cromatógrafo líquido para introduzir uma terceira fase móvel e combina um gradiente tradicional de fase invertida com um gradiente lipídico-passível. Preparação de grãos, extração metabólica, análise instrumental e fluxos de trabalho de processamento de dados são descritos em detalhes. Foi observada boa precisão de massa e reprodutibilidade de sinal, e o método produziu aproximadamente 500 características biologicamente relevantes por modo de ionização. Além disso, foram determinados sinais de características metabólicas e lipídicas significativamente diferentes entre as variedades de trigo.

Introduction

Compreender as interações entre genes, meio ambiente e práticas de manejo na agricultura poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e da qualidade do produto. Os metabólitos vegetais são influenciados por fatores como o genoma, o ambiente (clima, chuvas etc.), e em um ambiente agrícola, a forma como as culturas são gerenciadas (ou seja, aplicação de fertilizantes, fungicidas etc.). Ao contrário do genoma, o metabolome é influenciado por todos esses fatores e, portanto, os dados metabolômicos fornecem uma impressão digital bioquímica dessas interações em um determinado momento. Geralmente, há uma das duas metas para um estudo baseado em metabolômica: em primeiro lugar, obter uma compreensão mais profunda da bioquímica do organismo e ajudar a explicar o mecanismo de resposta à perturbação (estresse abiótico ou biótico) em relação à fisiologia; e, em segundo lugar, associar biomarcadores com a perturbação em estudo. Em ambos os casos, o resultado de ter esse conhecimento é uma estratégia de gestão mais precisa para alcançar o objetivo de melhorar o tamanho e a qualidade do rendimento.

Prevê-se que o metabolome da planta contenha milhares depequenas moléculas com variadas propriedades físico-químicas. Atualmente, nenhuma plataforma metabolômica (espectrometria de massa predominantemente e espectroscopia de ressonância magnética nuclear) pode capturar todo o metabolome em uma única análise. Desenvolver tais técnicas (preparação da amostra, extração e análise metabólica), que fornecem a maior cobertura possível do metabolome dentro de uma única corrida analítica, é um objetivo fundamental para os pesquisadores de metabolômica. Análises metabolômicas não direcionadas anteriores de grãos de trigo combinaram dados de múltiplas separações cromatográficas e polaridades de aquisição e/ou instrumentação para maior cobertura metabolome. No entanto, isso exigiu que as amostras fossem preparadas e adquiridas separadamente para cada modalidade. Por exemplo, Beleggia et al.2 prepararam uma amostra derivatizada para a análise de ánlytes polares gc-ms, além da análise gc-ms dos analytes não polares. Das et al.3 utilizaram métodos GC e LC-MS para melhorar a cobertura em suas análises; no entanto, essa abordagem exigiria geralmente preparações amostrais separadas como descrito acima, bem como duas plataformas analíticas independentes. Análises anteriores de grãos de trigo utilizando GC-MS3,5 2,,3,,4 e LC-MS 3 , 5 plataformas produziram 50 a 412 (55 identificados) recursos para GC-MS, 409 para GC-MS e LC-MS combinados e vários milhares para análise de lipidomia slc-MS5. Ao combinar pelo menos dois modos em uma única análise, a cobertura metabolome estendida pode ser mantida, aumentando a riqueza da interpretação biológica e, ao mesmo tempo, oferecendo economia tanto no tempo quanto no custo.

Para permitir a separação eficiente de uma ampla gama de espécies lipídicas por cromatografia de fase invertida, as metodologias de lipidomia modernas geralmente utilizam uma alta proporção de isopropanol no solvente de elução6, proporcionando amenidade às classes lipídicas que poderiam ser não resolvidas pela cromatografia. Para uma separação lipídica eficiente, a fase móvel inicial também é muito maior na composição orgânica7 do que os métodos cromatográficos de fase invertidos típicos, que consideram outras classes de moléculas. A alta composição orgânica no início do gradiente torna esses métodos menos adequados para muitas outras classes de moléculas. Mais notavelmente, a cromatografia líquida de fase invertida emprega um gradiente binário solvente, começando com uma composição principalmente aquosa e aumentando em conteúdo orgânico à medida que a força de eluição da cromatografia é aumentada. Para tanto, buscou-se combinar as duas abordagens para alcançar a separação das classes lipídicas e não lipídicas de metabólitos em uma única análise.

Aqui, apresentamos um método cromatográfico que utiliza uma terceira fase móvel e permite um método de cromatografia de fase reversa e lipidomics adequado à lipidomia usando uma única preparação de amostra e uma coluna analítica. Adotamos muitas das medidas de controle de qualidade e etapas de filtragem de dados que já foram implementadas em estudos de metabolômica predominantemente clínica. Essas abordagens são úteis na determinação de características robustas com alta reprodutibilidade técnica e relevância biológica e excluem aquelas que não atendem a esses critérios. Por exemplo, descrevemos a repetição da amostra de QC agrupada8, correção QC9, filtragem de dados9,,10 e imputação de recursos ausentes11.

Protocol

Este método é apropriado para 30 amostras (aproximadamente 150 sementes por amostra). Três réplicas biológicas de dez variedades diferentes de trigo cultivados em campo foram usadas aqui. 1. Preparação de grãos Recuperar amostras (grãos integrais) de -80 °C de armazenamento.NOTA: A secagem congelante das sementes é recomendada logo após a colheita se as amostras estiverem sendo coletadas em várias estações. Isso minimiza quaisquer alterações na concentração met…

Representative Results

O metabolome vegetal é influenciado por uma combinação de seu genoma e ambiente, e adicionalmente em um ambiente agrícola, o regime de manejo de culturas. Demonstramos que as diferenças genéticas entre as variedades de trigo podem ser observadas no nível metabólito, aqui, com mais de 500 compostos medidos mostrando concentrações significativamente diferentes entre as variedades apenas no grão. Boa precisão de massa (<10 ppm erro) e reprodutibilidade de sinal (<20% RSD) das nor…

Discussion

Aqui, apresentamos um método de metabolômica não direcionado à base de LC-MS para a análise de grãos de trigo. O método combina quatro modos de aquisição (fase invertida e fase invertida com ionização positiva e negativa) em dois modos, introduzindo uma terceira fase móvel no gradiente de fase invertida. A abordagem combinada produziu aproximadamente 500 características biologicamente relevantes por polaridade de íons, com cerca de metade dessas significativamente diferentes em intensidade entre as variedad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de reconhecer o programa de Bolsas de Agricultura e Alimentação do Primeiro-Ministro da Austrália Ocidental (Departamento de Empregos, Turismo, Ciência e Inovação, Governo da Austrália Ocidental) e o Primeiro-Ministro, professor Simon Cook (Centro para Agricultura Digital, Universidade de Curtin e Universidade Murdoch). Os ensaios de campo e a coleta de amostras de grãos foram apoiados pelo governo do programa Royalties for Regions da Austrália Ocidental. Reconhecemos Grantley Stainer e Robert French por suas contribuições para testes de campo. As Bioplataformas da Austrália, financiadas pelo NCRIS, são reconhecidas pelo financiamento de equipamentos.

Materials

13C6-sorbitol Merck Sigma-Aldrich 605514
2-aminoanthracene Merck Sigma-Aldrich A38800-1 g
Acetonitrile ThermoFisher Scientific FSBA955-4 Optima LC-MS grade
Ammonium formate Merck Sigma-Aldrich 516961-100 mL >99.995%
Analyst TF Sciex Version 1.7
AnalyzerPro software SpectralWorks Ltd. Data processing software used for step 7.2. Version 5.7
AnalyzerPro XD sortware SpectralWorks Ltd. Data processing software used for step 7.5. Version 1.4
Balance Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.
d6-transcinnamic acid Isotec 513962-250 mg
Formic acid Ajax Finechem Pty. Ltd. A2471-500 mL 99%
Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) Labconco 7670031
Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)
Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) Velocity Scientific Solutions VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)
Installation kit for Sciex TripleToF Sciex p/n 4456736
Isopropanol ThermoFisher Scientific FSBA464-4 Optima LC-MS grade
Laboratory blender Waring commercial Model HGBTWTS3
Leucine-enkephalin Waters p/n 700008842 Tuning solution
Metaboanalyst https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.
Methanol ThermoFisher Scientific FSBA456-4 Optima LC-MS grade
Miconazole Merck Sigma-Aldrich M3512-1 g
Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) 5426 No. 0021716
Microcentrifuge tubes (2 mL) SSIbio 1310-S0
Microsoft Office Excel Microsoft
Peak View software Sciex Version 1.2 (64-bit)
Pipette tips (200 uL, 100 uL) ThermoFisher Scientific MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)
Pipettes (200 uL, 1000 uL) ThermoFisher Scientific
Plastic centrifuge tubes (15 mL) ThermoFisher Scientific NUN339650
Progenesis QI Nonlinear Dynamics Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)
Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer Sciex
Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads Bertin Technologies
Sodium formate Merck Sigma-Aldrich 456020-25 g
Tissue lyser/homogeniser Bertin Technologies Serial 0001620
Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)
Vortex mixer IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) 001722
Water ThermoFisher Scientific FSBW6-4 Optima LC-MS grade
Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps Waters
Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column Waters p/n 186005614

References

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  2. Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
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Cite This Article
Abbiss, H., Gummer, J. P. A., Francki, M., Trengove, R. D. Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain. J. Vis. Exp. (157), e60851, doi:10.3791/60851 (2020).

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