Isolamento delle cellule mononucleari del Tonsillar per studiare le risposte immunitarie innate Ex Vivo in un tessuto linfoide mucosale umano
Summary
Nel protocollo attuale, spieghiamo come elaborare e coltura facilmente le cellule mononucleari tonsillare da esseri umani sani sottoposti a tonsillectomia chirurgica parziale per studiare le risposte immunitarie innate dopo l’attivazione, imitando l’infezione virale nei tessuti mucosali.
Abstract
Lo studio di cellule isolate da tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALT) consente di comprendere la risposta delle cellule immunitarie nelle patologie che coinvolgono l’immunità mucosale, perché possono modellare le interazioni ospite-patogeno nel tessuto. Mentre le cellule isolate derivate dai tessuti sono state il primo modello di coltura cellulare, il loro uso è stato trascurato perché il tessuto può essere difficile da ottenere. Nel protocollo attuale, spieghiamo come elaborare e coltura facilmente le cellule mononucleari tonsille (TMC) da tonsille umane sane per studiare le risposte immunitarie innate al momento dell’attivazione, imitando l’infezione virale nei tessuti mucosali. L’isolamento dei TMC dalle tonsille è rapido, perché le tonsille hanno a malapena alcun epitelio e producono fino a miliardi di tutti i principali tipi di cellule immunitarie. Questo metodo consente di rilevare la produzione di citochine utilizzando diverse tecniche, tra cui immunoassays, qPCR, microscopia, citometria di flusso, ecc., simili all’uso di cellule mononucleari periferiche (PBMC) dal sangue. Inoltre, i TMC mostrano una maggiore sensibilità ai test antidroga rispetto ai PMC, che devono essere considerati per i test di tossicità futuri. Pertanto, le colture ex vivo TMC sono un modello mucosale facile e accessibile.
Introduction
Gli studi sugli organi umani sono limitati a causa dell’accessibilità e di ovvie ragioni etiche. Tuttavia, sono essenziali per comprendere appieno la complessità della biologia umana. Le colture di cellule isolate (colture primarie o linee cellulari) sono un sistema standard negli studi di biologia cellulare a causa della loro disponibilità. Mentre le colture di cellule isolate hanno permesso scoperte eccezionali, l’uso di linee cellulari è venuto su un esame più attento perché non imitano completamente la biologia degli organi in vivo. Tuttavia, la coltura di cellule tridimensionali o espianti tissutali è altamente complessa4,5,6. Infatti, un pezzo di tessuto o organo è altamente eterogeneo perché la sua composizione cellulare differisce a seconda della localizzazione nel tessuto. Pertanto, l’utilizzo di blocchi di tessuto richiede l’analisi di molti repliche tecniche e biologiche, portando alla necessità di un gran numero di donatori o pazienti.
I tessuti linfoidi associati alla mucosa (MALT) sono strutturalmente simili ai linfonodi ma hanno funzioni uniche, perché il loro ruolo principale è quello di regolare l’immunitàmucosale 7. A differenza dei linfonodi, che di solito si trovano ad una certa distanza dai tessuti, i MALT si trovano generalmente immediatamente sotto l’epitelio del tessuto mucosale. Istologicamente, sono composti principalmente da alte concentrazioni di cellule B e T, ma anche cellule che presentano antigene come macrofagi e cellule dendritiche. MALT costituiscono circa il 50% del tessuto linfoide nel corpo umano. I MALT sono suddivisi in nove gruppi a seconda della loro posizione: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjunctival), LALT (larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizzato) e D-MALT (diffuso). L’O-MALT è composto principalmente dalle tonsille dell’anello tonsillare di Waldeyer ed è il MALT8,,9più accessibile. Infatti, le tonsille situate nell’oropharynx costituiscono la principale barriera che protegge le vie digerenti e respiratorie dai microrganismi invasivi10. Inoltre, le tonsille sono coperte da un sottile epitelio squamoso non-cheratinizzante, supportato da una capsula di tessuto connettivo contenente vasi sanguigni, nervi e linfatici, fornendo un facile accesso alle cellule immunitarie11,12. Inoltre, la tonsillectomia, l’atto chirurgico di rimozione delle tonsille, è una procedura comune eseguita sui bambini che hanno la respirazione disordinata di sonno, rendendo le tonsille un tessuto facilmente disponibile13 in contesti fisiologici.
Tonsils permettono lo studio della risposta delle cellule immunitarie in patologie che coinvolgono l’immunità mucosale. Infatti, nell’infezione da HIV, perché le tonsille sono composte da un’alta concentrazione di cellule immunitarie, sono il bersaglio principale della replicazione virale ma producono anche una grande quantità di citochine che non vengono rilevate nella circolazione14,15. A stati costanti, popolazioni rare di cellule simili innate sono presenti in vari tessuti mucosali, comprese le tonsille, ma sono essenzialmente assenti dal sangue.
Pertanto, le cellule mononucleari provenienti da tonsille (TMC) sono un modello più rilevante e complesso dei PBMC e possono rispondere a domande più profonde. D’altra parte, l’uso di espianti tissutali può essere complesso e non sempre rilevante per studi immunitari innati. Così, abbiamo stabilito un modello per studiare l’attivazione immunitaria mucosale utilizzando TMC16. Qui, descriviamo un metodo per un isolamento efficiente dei TMC dalle tonsille umane fresche. Questo metodo consente il recupero di un gran numero di cellule immunitarie pur mantenendo la loro integrità per gli studi ex vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tonsille umane rappresentano un modello ex vivo integrativo e fisiologico per studiare le risposte immunitarie innate nell’interfaccia mucosale, perché imitano il ruolo di un organo linfoide secondario. È interessante notare che la composizione cellulare dei TMC è simile ai PMC e include tutte le principali popolazioni di cellule, anche se la loro percentuale può essere diversa dai PMC dal sangue (Figura 1). Ulteriori popolazioni possono anche essere trovate, come tutte le risposte im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) per gli esperimenti e la borsa di studio N.B. (AAP 2017 166). N.S. riconosce il sostegno dell’ANRS per la borsa di studio (AAP 2016 1), l’Organizzazione europea di biologia molecolare EMBO for Fellowship (LT 834 2017), il programma di finanziamento per le startup “Baustein” della Facoltà di Medicina dell’Università di Ulm (LSBN.0147) e la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
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