Summary

Un tableau de gouttelettes femtoliter pour la synthèse massive de protéines parallèles à partir de molécules d’ADN unique

Published: June 20, 2020
doi:

Summary

L’objectif global du protocole est de préparer plus d’un million de gouttelettes de femtoliter commandées, uniformes, stables et biocompatibles sur un substrat planaire de 1 cm2 qui peut être utilisé pour la synthèse des protéines sans cellules.

Abstract

Les progrès réalisés dans la résolution spatiale et la sensibilité à la détection de l’instrumentation scientifique permettent d’appliquer de petits réacteurs pour la recherche biologique et chimique. Pour répondre à la demande de microréacteurs haute performance, nous avons mis au point un dispositif femtoliter droplet array (FemDA) et illustré son application dans des réactions massivement parallèles de synthèse de protéines sans cellules (CFPS). Plus d’un million de gouttelettes uniformes ont été facilement générées dans une zone de la taille d’un doigt à l’aide d’un protocole d’étanchéité à l’huile en deux étapes. Chaque gouttelette était ancrée dans une microchamber femtoliter composée d’un fond hydrophile et d’un paroi latérale hydrophobe. La structure hydrophile-in-hydrophobe hybride et les huiles d’étanchéité et les surfactants dédiés sont essentiels pour conserver de façon stable la solution aqueuse femtoliter dans l’espace femtoliter sans perte d’évaporation. La configuration femtoliter et la structure simple du dispositif FemDA ont permis une consommation minimale de réactifs. La dimension uniforme des réacteurs à gouttelettes a rendu les mesures quantitatives et temporelles à grande échelle convaincantes et fiables. La technologie FemDA a corrélé le rendement protéique de la réaction du SCFP avec le nombre de molécules d’ADN dans chaque gouttelette. Nous avons rationalisé les procédures concernant la microfabrication de l’appareil, la formation des gouttelettes de femtoliter, et l’acquisition et l’analyse des données d’image microscopiques. Le protocole détaillé avec le faible coût de fonctionnement optimisé rend la technologie FemDA accessible à tous ceux qui ont des installations de nettoyage standard et un microscope à fluorescence classique à leur place.

Introduction

Les chercheurs utilisent des réacteurs pour effectuer des réactions bio/chimiques. Des efforts importants ont été déployés pour réduire la taille du réacteur et augmenter le débit expérimental afin de réduire la consommation de réactifs tout en améliorant l’efficacité du travail. Ces deux aspects visent à libérer les chercheurs d’une lourde charge de travail, en réduisant les coûts et en accélérant la recherche et le développement. Nous disposons d’une feuille de route historique claire sur le développement des technologies des réacteurs du point de vue des volumes de réaction et du débit : béchers/flacons/tubes à essai simples, tubes millilitres, tubes microlitres, microlitres 8 tubes, microlitres 96/384/1536-puits, et nanolitre microfluidique/picoliter/femtoliter réacteurs1,2,3,4,5,6,7. Analogue à la réduction de la taille des caractéristiques des transistors sur les puces de circuits intégrés dans l’industrie des semi-conducteurs au cours des dernières décennies, les microréacteurs bio/chimiques sont en cours de réduction du volume et d’intégration du système. Ces outils à petite échelle ont eu un impact profond sur la biologie synthétique à base de cellules ou sans cellules, la biomaufacturing, et le prototypage et le dépistage à haut débit8,9,10,11,12. Cet article décrit nos efforts récents sur le développement d’une technologie unique de tableau de gouttelettes et démontre son application dans CFPS13, une technologie fondamentale pour la biologie synthétique et les communautés de dépistage moléculaire14. En particulier, nous fournissons intentionnellement un protocole optimisé et peu coûteux pour rendre le dispositif FemDA accessible à tous. Le protocole à faible coût et facile à manipuler pour l’appareil miniaturisé contribuerait aux objectifs éducatifs des universités et aiderait à diffuser la technologie.

FemDA prépare des gouttelettes de femtoliter à une densité ultra-élevée de 106 par 1 cm2 sur un substrat en verre planaire. Nous avons enduit un polymère hydrophobe, CYTOP15, sur le substrat de verre et gravé sélectivement (enlevé) CYTOP à des positions prédéfinies pour générer un tableau de microchambre sur le substrat. Ainsi, la microchambre qui en résulte est composée d’une paroi hydrophobe (CYTOP) et d’un fond hydrophile (verre). Lorsque l’eau et l’huile coulent séquentiellement sur la surface à motifs, l’eau peut être emprisonnée et scellée dans les microchambres. La structure hydrophile-in-hydrophobe est essentielle pour repousser l’eau à l’extérieur des microchambres, isoler les microréacteurs individuels et conserver une minuscule solution aqueuse à l’intérieur de l’espace femtoliter. La propriété unique a été appliquée avec succès pour la préparation de gouttelettes d’eau dans l’huile et de microcompartements bicalaires lipidiques16,17. Par rapport au prototype16, nous avons d’abord optimisé le processus de microfabrication pour réaliser une élimination complète du polymère CYTOP ainsi qu’une exposition complète du fond de verre. CYTOP est un fluoropolymère spécial dont la tension de surface est extrêmement faible (19 mN/m) inférieure à celle des matériaux microréacteurs conventionnels tels que le verre, les plastiques et le silicone. Ses bonnes performances optiques, électriques et chimiques ont déjà été utilisées dans le traitement de surface des dispositifs microfluidiques18,19,20,21,22,23,24. Dans le système FemDA, pour obtenir un bon mouillage de l’huile sur la surface du CYTOP, la tension de surface de l’huile doit être inférieure à celle de la surface solide25. Sinon, l’huile liquide en contact avec la surface solide tend à devenir sphérique plutôt que de se répandre sur la surface. En outre, nous avons constaté que certaines huiles populaires de perfluorocarbone (par exemple, 3M FC-40)16 et les huiles hydrofluoroéther (par exemple, 3M série Novec) peuvent dissoudre CYTOP à la suite de la morphologie amorphe de CYTOP, qui est fatale à la mesure quantitative et serait discutable en termes de contamination croisée entre les gouttelettes. Heureusement, nous avons identifié une huile biocompatible et respectueuse de l’environnement présentant une tension de surface inférieure (< 19 mN/m)13. Nous avons également trouvé un nouveau surfactant qui peut se dissoudre dans l’huile sélectionnée et fonctionner dans une faible concentration (0,1%, au moins 10 fois plus faible que précédemment rapporté populaires26,27)13. L’interface eau/huile qui en résulte peut être stabilisée par le surfactant. En raison du taux d’évaporation élevé de l’huile, après la chasse d’eau avec l’huile, nous avons appliqué une autre huile biocompatible et respectueuse de l’environnement pour remplacer la première pour sceller les microchambres. Nous appelons la première huile (ASASHIKLIN AE-3000 avec 0,1 wt % SURFLON S-386) l’huile de chasse d’eau et la deuxième huile (Fomblin Y25) l’huile d’étanchéité, respectivement.

La stratégie d’étanchéité à l’huile en deux étapes peut réaliser une formation robuste du tableau de gouttelettes femtoliter en quelques minutes et sans instrumentation sophistiquée. En raison du problème d’évaporation, il a été considéré comme difficile de générer des microréacteurs plus petits que les volumes de picolteur28. FemDA a abordé ce problème en optimisant systématiquement les matériaux et les procédés utilisés pour la préparation des microréacteurs/gouttelettes. Plusieurs caractéristiques notables des gouttelettes résultantes incluent l’uniformité élevée (ou monodispersité), la stabilité, et la biocompatibilité à l’échelle femtoliter. Le coefficient de variation (CV) du volume des gouttelettes n’est que de 3% (sans correction de vignette pour les images microscopiques), le plus petit CV parmi les plates-formes de gouttelettes dans le monde, ce qui assure une mesure très parallèle et quantitative. La gouttelette de femtoliter est stable pendant au moins 24 heures sans contamination croisée entre les gouttelettes à température ambiante, ce qui est précieux pour une mesure fiable du cours du temps. En ce qui concerne la biocompatibilité, nous avons réussi à synthétiser diverses protéines à partir d’un modèle d’ADN à copie unique dans la gouttelette femtoliter, qui avait été précédemment considéré comme difficile ou inefficace29,30. Il serait digne d’élucider pourquoi certaines protéines capables d’être synthétisées dans le FemDA ne peuvent pas être synthétisées dans d’autres systèmes de gouttelettes. FemDA n’était pas seulement un progrès technique, mais a également réalisé une mesure quantitative sans précédent qui peut corréler le rendement des protéines (tel que reflété par l’intensité de fluorescence de la gouttelette) au nombre de molécules d’ADN de modèle dans chaque gouttelette. En conséquence, l’histogramme de l’intensité de fluorescence des gouttelettes du CFPS à base de FemDA a montré une distribution discrète qui peut être bien ajustée par une somme de distributions gaussiennes d’intervalles de pointe à pic égaux. En outre, la probabilité d’occurrence de gouttelettes contenant différents nombres de molécules d’ADN était un ajustement parfait à une distribution poisson31. Ainsi, le rendement protéique différent dans chaque gouttelette peut être normalisé en fonction de la distribution discrète. Cette caractéristique critique nous permet de séparer l’information d’activité enzymatique de l’intensité apparente, qui n’a pas encore été disponible avec d’autres plates-formes de microréacteurs. Les systèmes de tri des cellules/gouttelettes microfluidiques existants sont habiles dans le tri entièrement automatique et bons pour concentrer des échantillons, mais parfois ne peuvent produire qu’un histogramme relativement large ou à longue queue dans l’aspect analytique32,33. Notre système FemDA hautement quantitatif et biocompatible établit une nouvelle référence et une norme analytique élevée dans le domaine du développement des microréacteurs.

Les huiles et les surfactants qui pourraient être utilisés pour la préparation des gouttelettes sont encore très limitées34. La combinaison d’ASASHIKLIN AE-3000 et DE SURFLON S-386 établie à FemDA est un nouveau membre de l’arsenal croissant de l’interface physiochimique entre la phase aqueuse et la phase13de l’huile. La nouvelle interface de FemDA est physiquement stable, chimiquement inerte et biologiquement compatible avec les machines complexes de transcription, de traduction et de modification post-translationnelle pour de nombreuses sortes de protéines13. Il serait plutôt intéressant de trouver une protéine qui ne peut pas être synthétisée dans les paramètres de gouttelettes à la place. En outre, l’économie de coûts des réactifs est plus évidente dans le système de gouttelettes femtoliter que celle dans les systèmes de réacteurs nanolitres et picoliter35,36. En particulier, il y aurait souvent un grand volume mort, qui est principalement causé par des tubes ou des fournitures externes, dans les systèmes de génération de gouttelettes microfluidiques, mais pas dans notre FemDA. Le format de tableau est également favorisé par une caractérisation microscopique répétée et détaillée (similaire à ce qu’on appelle l’analyse à haute teneur) pour chaque réacteur37, plutôt que par un seul instantané pour un objet en mouvement rapide. L’échelle femtoliter a permis l’intégration de plus d’un million de réacteurs sur une zone de la taille d’un doigt, alors que le même nombre de réacteurs nanolitres (s’il existe) nécessite une superficie de plus de mètres carrés, ce qui ne serait sans aucun doute pas pratique pour fabriquer ou utiliser un tel système.

Protocol

1. Microfabrication du substrat de microchambre femtoliter REMARQUE : Effectuez l’expérience de microfabrication suivante dans une salle propre. Portez des gants et un costume de chambre blanche avant d’entrer dans la salle blanche. Substrat de verre de couverture de nettoyage Placez le verre de couverture sur une grille de coloration en verre de couverture. Soniré le verre de couverture en hydroxyde de sodium de 8 M (NaOH) pendant 15 min à température ambiante (RT).<…

Representative Results

Le processus de microfabrication consiste en le nettoyage du substrat, la fonctionnalisation de surface, le revêtement CYTOP, la photolithographie, la gravure sèche, le décapage photorésiste et le nettoyage final. Fait important, le protocole présenté a permis l’enlèvement complet du polymère cytop hydrophobe à l’intérieur des microchambres Figure 3A),produisant une structure hydrophile-in-hydrophobe très parallèle sur un substrat en verre de couverture standard. À l’aide …

Discussion

La mesure hautement quantitative basée sur les gouttelettes hautement uniformes, stables et biocompatibles de FemDA a permis la distribution discrète, la caractéristique unique de notre étude différant des autres. Nous avons systématiquement optimisé et détaillé les processus de microfabrication et de formation de gouttelettes dans cet article. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole établi.

Tout d’abord, le revêtement uniforme du polymère CYTOP très visqueux sur le…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par le numéro de subvention JSPS KAKENHI JP18K14260 et le budget de l’Agence japonaise pour les sciences et la technologie de la Terre marine. Nous remercions Shigeru Deguchi (JAMSTEC) et Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) d’avoir fourni les installations de caractérisation. Nous remercions Ken Takai (JAMSTEC) pour le support logiciel commercial. La microfabrication a été réalisée à Takeda Sentanchi Supercleanroom, l’Université de Tokyo, soutenue par le « Nanotechnology Platform Program » du Ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (MEXT), Japon, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X., Fan, C. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. , 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C., Conn, P. M. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. , 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. . Digital image processing. , (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

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Cite This Article
Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

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