Un arreglo de gotas Femtoliter para la síntesis masiva de proteínas paralelas a partir de moléculas de ADN únicas

Summary

El objetivo general del protocolo es preparar más de un millón de gotas de femtoliter ordenadas, uniformes, estables y biocompatibles sobre un sustrato plano de 1 cm² que se puede utilizar para la síntesis de proteínas libres de células.

Abstract

Los avances en la resolución espacial y la sensibilidad de detección de la instrumentación científica permiten aplicar pequeños reactores para la investigación biológica y química. Para satisfacer la demanda de microrreactores de alto rendimiento, desarrollamos un dispositivo de matriz de gotas femtoliter (FemDA) y ejemplificamos su aplicación en reacciones de síntesis de proteínas sin células (CFPS) masivamente paralelas. Más de un millón de gotas uniformes se generaron fácilmente dentro de un área del tamaño de un dedo utilizando un protocolo de sellado de aceite de dos pasos. Cada gota estaba anclada en una microcámara femtoliter compuesta de un fondo hidrófilo y una pared lateral hidrófoba. La estructura híbrida hidrófila en hidrofóbica y los aceites y tensioactivos de sellado dedicados son cruciales para retener establemente la solución acuosa femtoliter en el espacio femtoliter sin pérdida de evaporación. La configuración de femtoliter y la estructura simple del dispositivo FemDA permitían un consumo mínimo de reactivos. La dimensión uniforme de los reactores de gotas hizo que las mediciones cuantitativas y de tiempo a gran escala fueran convincentes y confiables. La tecnología FemDA correlacionó el rendimiento proteico de la reacción CFPS con el número de moléculas de ADN en cada gota. Hemos simplificado los procedimientos sobre la microfabricación del dispositivo, la formación de las gotas femtoliter y la adquisición y análisis de los datos de imagen microscópica. El protocolo detallado con el bajo costo de funcionamiento optimizado hace que la tecnología FemDA sea accesible para todos los que tienen instalaciones estándar de salas limpias y un microscopio de fluorescencia convencional en su propio lugar.

Introduction

Los investigadores utilizan reactores para llevar a cabo reacciones bio/químicas. Hay esfuerzos significativos que se han hecho para reducir el tamaño del reactor y aumentar el rendimiento experimental con el fin de reducir el consumo de reactivos al tiempo que se mejora la eficiencia del trabajo. Ambos aspectos tienen como objetivo liberar a los investigadores de una carga de trabajo pesada, disminuyendo el costo y acelerando la investigación y el desarrollo. Tenemos una hoja de ruta histórica clara sobre el desarrollo de las tecnologías de reactores desde el punto de vista de los volúmenes de reacción y el rendimiento: vasos individuales / matraz / tubos de prueba, tubos de mililitro, tubos microlitro, tiras de microlitro de 8 tubos, placa de microlitro 96/384/1536-well, y reactores microfluídicos nanolitros/picolitr/femtoliter^{1,2,3,4,5,6,7}. Análogos a la reducción del tamaño de las características de los transistores en chips de circuito integrado en la industria de semiconductores en las últimas décadas, los microrreactores bioquímicos están pasando por la reducción de volumen y la integración del sistema. Estas herramientas a pequeña escala han tenido un profundo impacto en la biología sintética basada en células o en la sin células, la biomanufactura y el prototipado y cribado de alto rendimiento^{8,,9,,10,,11,,12}. Este artículo describe nuestro reciente esfuerzo en el desarrollo de una tecnología única de arreglos de gotas y demuestra su aplicación en CFPS^13,una tecnología fundamental para la biología sintética y las comunidades de cribado molecular¹⁴. En particular, proporcionamos intencionalmente un protocolo optimizado y de bajo costo para hacer que el dispositivo FemDA sea accesible para todos. El protocolo de bajo costo y fácil de manejar para el dispositivo miniaturizado contribuiría a los propósitos educativos de las universidades y ayudaría a difundir la tecnología.

FemDA prepara gotas de femtoliter a una densidad ultra alta de 10⁶ por 1 cm² en un sustrato de vidrio plano. Recubrimos un polímero hidrófobo, CYTOP^15,sobre el sustrato de vidrio y grabado selectivamente (eliminado) CYTOP en posiciones predefinidas para generar una matriz de microcámaras en el sustrato. Por lo tanto, la microcámara resultante se compone de una pared lateral hidrófoba (CYTOP) y un fondo hidrófilo (vidrio). Cuando el agua y el aceite fluyen secuencialmente sobre la superficie estancada, el agua puede ser atrapada y sellada en las microcámaras. La estructura hidrófila-en-hidrofóbica es vital para repeler el agua fuera de las microcámaras, aislar microrreactores individuales y retener una pequeña solución acuosa dentro del espacio femtoliter. La propiedad única se aplicó con éxito para la preparación de gotas de agua en aceite y microcomplementos de bicapas de lípidos^16,17. En comparación con el prototipo de dispositivo^16,primero optimizamos el proceso de microfabricación para realizar una eliminación completa del polímero CYTOP, así como una exposición completa del fondo de vidrio. CYTOP es un fluoropolímero especial con una tensión superficial extremadamente baja (19 mN/m) inferior a la de los materiales de microrreactor convencionales como vidrio, plásticos y silicona. Su buen rendimiento óptico, eléctrico y químico ya se ha utilizado en el tratamiento superficial de dispositivos microfluídicos^{18,,19,20,21,22,23,24}. En el sistema FemDA, para lograr una buena humectación del aceite en la superficie CYTOP, la tensión superficial del aceite debe ser inferior a la de la superficie sólida^25. De lo contrario, el aceite líquido en contacto con la superficie sólida tiende a ser esférico en lugar de extenderse por la superficie. Además, encontramos que algunos aceites de perfluorocarbono populares (por ejemplo, 3M FC-40)¹⁶ y aceites hidrofluoroéter (por ejemplo, la serie 3M Novec) pueden disolver CYTOP como resultado de la morfología amorfa de CYTOP, que es fatal para la medición cuantitativa y sería cuestionable en términos de contaminación cruzada entre gotas. Afortunadamente, identificamos un aceite biocompatible y respetuoso con el medio ambiente que exhibe una tensión superficial inferior (< 19 mN/m)¹³. También encontramos un nuevo tensioactivo que puede disolverse en el aceite seleccionado y funcionar en una concentración baja (0,1%, al menos 10 veces menor que los populares reportados anteriormente^26,27)¹³. El surfactante puede estabilizar la interfaz de agua/aceite resultante. Debido a la alta tasa de evaporación del aceite, después del lavado con el aceite, aplicamos otro aceite biocompatible y respetuoso con el medio ambiente para reemplazar el primero para sellar las microcámaras. Llamamos al primer aceite (ASAHIKLIN AE-3000 con 0,1 wt % SURFLON S-386) el “aceite de lavado” y el segundo aceite (Fomblin Y25) el “aceite de sellado”, respectivamente.

La estrategia de sellado de aceite de dos pasos puede realizar una formación robusta de la matriz de gotas femtoliter en cuestión de minutos y sin instrumentación sofisticada. Debido al problema de evaporación, se ha considerado difícil generar microrreactores más pequeños que los volúmenes de picolitr^28. FemDA abordó este problema optimizando sistemáticamente los materiales y procesos utilizados para la preparación de microrreactores/gotas. Varias características destacables de las gotas resultantes incluyen la alta uniformidad (o monodispersidad), estabilidad y biocompatibilidad a escala femtoliter. El coeficiente de variación (CV) del volumen de las gotas es de sólo 3% (sin corrección de viñetas para las imágenes microscópicas), el CV más pequeño entre las plataformas de gotas en el mundo, lo que asegura una medición altamente paralela y cuantitativa. La gota femtoliter es estable durante al menos 24 horas sin contaminación cruzada entre gotas a temperatura ambiente, lo que es valioso para una medición fiable del tiempo. En cuanto a la biocompatibilidad, logramos sintetizar varias proteínas a partir de una plantilla de ADN de una sola copia en la gota femtoliter, que anteriormente se había considerado difícil o ineficiente^29,,30. Sería digno de esclarecer por qué algunas proteínas capaces de ser sintetizadas en el FemDA no se pueden sintetizar en otros sistemas de gotas. FemDA no fue simplemente un avance técnico, sino que también realizó una medición cuantitativa sin precedentes que puede correlacionar el rendimiento proteico (como refleja la intensidad de fluorescencia de la gota) con el número de moléculas de ADN de plantilla en cada gota. Como resultado, el histograma de la intensidad de fluorescencia de las gotas de CFPS basado en FemDA mostró una distribución discreta que puede ser bien ajustada por una suma de distribuciones gaussianas de intervalos iguales pico a pico. Además, la probabilidad de aparición de gotas que contienen diferentes números de moléculas de ADN era un ajuste perfecto a una distribución de Poisson³¹. Por lo tanto, el rendimiento proteico diferente en cada gota se puede normalizar en función de la distribución discreta. Esta característica crítica nos permite separar la información de actividad enzimática de la intensidad aparente, que aún no ha estado disponible con otras plataformas de microrreactores. Los sistemas de clasificación de células/gotas microfluídicas existentes son expertos en clasificación totalmente automática y buenos para concentrar muestras, pero a veces sólo pueden generar un histograma relativamente amplio o de cola larga en el aspecto analítico^32,,33. Nuestro sistema FemDA altamente cuantitativo y biocompatible establece un nuevo punto de referencia y un alto estándar analítico en el campo del desarrollo de microrreactores.

Los aceites y tensioactivos que podrían ser utilizados para la preparación de gotas son todavía muy^{limitados 34.} La combinación de ASAHIKLIN AE-3000 y SURFLON S-386 establecida en FemDA es un nuevo miembro del creciente arsenal de la interfaz fisioquímica entre la fase acuosa y la fase de aceite¹³. La nueva interfaz de FemDA es físicamente estable, químicamente inerte y biológicamente compatible con la compleja herramienta de transcripción, traducción y modificación post-traduccional para muchos tipos de proteínas¹³. Sería bastante atractivo encontrar una proteína que no se puede sintetizar en la configuración de gotas en su lugar. Además, el ahorro de costes de los reactivos es más evidente en el sistema de gotas femtoliter que en los sistemas de reactores nanolitros y picolitros^35,36. En particular, a menudo habría un gran volumen muerto, que es causado principalmente por tubos o suministros externos, en sistemas de generación de gotas microfluídicas, pero no en nuestro FemDA. El formato de matriz también se ve favorecido por la caracterización microscópica repetida y detallada (similar al llamado análisis de alto contenido) para cada reactor^37,en lugar de una sola instantánea para un objeto de movimiento rápido. La escala femtoliter permitió la integración de más de un millón de reactores en un área del tamaño de un dedo, mientras que el mismo número de reactores nanolitros (si existe) requiere sobre un área de metros cuadrados, lo que sin duda no sería práctico fabricar o utilizar dicho sistema.

Protocol

1. Microfabricación del sustrato de la matriz de microcámaras femtoliter NOTA: Lleve a cabo el siguiente experimento de microfabricación en una sala limpia. Use guantes y un traje de cuarto limpio antes de entrar en la sala limpia. Sustrato de vidrio de la cubierta de limpieza Ponga el vidrio de la cubierta en un estante de tinción de vidrio de cubierta. Sonicar el vidrio de la cubierta en hidróxido de sodio de 8 M (NaOH) durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).<b…

Representative Results

El proceso de microfabricación consiste en limpieza de sustratos, funcionalización de la superficie, recubrimiento CYTOP, fotolitografía, grabado en seco, desmontaje fotorresista y limpieza final. Es importante destacar que el protocolo presentado permitió la eliminación completa del polímero HIDROfóbico CYTOP dentro de las microcámaras Figura 3A),produciendo una estructura hidrófila-en-hidrófoba altamente paralela sobre un sustrato de vidrio de cubierta estándar. Con la ayuda del…

Discussion

La medición altamente cuantitativa basada en las gotas altamente uniformes, estables y biocompatibles en FemDA permitió la distribución discreta, la característica única de nuestro estudio diferenciándose de otros. Optimizamos y detallamos sistemáticamente los procesos de microfabricación y formación de gotas en este documento. Hay varios pasos críticos en el protocolo establecido.

En primer lugar, el recubrimiento uniforme del polímero CYTOP altamente viscoso en el sustrato rectang…

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140
1 mL syringe	Terumo	SS-01T
2-propanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope	Lasertec	OPTELICS HYBRID	Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe	Terumo	SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate	Thermo Fisher Scientific	D6567	Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.8%.
Air blower	Hozan	Z-263
Aluminum block	BIO-BIK	AB-24M-02
Aluminum microtube stand	BIO-BIK	AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper	Ozu	028208
Biopsy punch with plunger	Kai	BPP-10F
Cover glass	Matsunami Glass	No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)	Size-customized.
Cover glass staining rack	Nakayama	803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper	Nippon Paper Crecia	C100-M
Cutting mat	GE Healthcare	WB100020
CYTOP	AGC	CTL-816AP
Deaeration mixer	Thinky	AR-100
Desktop cutter	Roland	STIKA SV-8
Developer	AZ Electronic Materials	AZ 300 MIF	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape	Teraoka Seisakusho	7602 #25
Ethanol	Kanto Chemical	EL grade	EL: for electronic use. Purity 99.5%.
Fiji			Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter	Tokyo-IDEAL	MT-0100
Fomblin oil	Solvay	Y25, or Y25/6	Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate	AS ONE	TH-900
Injection needle	Terumo	NN-2270C	22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope	Nikon	Eclipse Ti-E	Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph	Synergy		Version: 4.5
Mask aligner	SUSS	MA-6	Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette	GILSON	E M250E	Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel	Microsoft		Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber	AS ONE	MVP-100MV
Nuclease-free water	NIPPON GENE	316-90101
Parafilm	Amcor	PM-996
PCR tube	NIPPON Genetics	FG-021D/SP
Petri dish	AS ONE	GD90-15	Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist	AZ Electronic Materials	AZ P4903	AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader	BioTek	POWERSCAN HT
Polyethelene gloves	AS ONE	6-896-02	Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit	New England Biolabs	E6800S or E6800L	For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system	Samco	RIE-10NR	Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S
Scotch tape	3M	810-1-18D
Sodium hydroxide solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	194-09575	8 M concentration; danger.
Spin coater	Oshigane	SC-308
SURFLON S-386 surfactant	AGC	(Test sample)	Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer	Dow	Sylgard184	Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers	Ideal-tek	2WF.SA.1 2A
Ultrasonic cleaner	AS ONE	ASU-2M
Vacuum chuck	Oshigane	(Customized)	Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).