本文详细描述了在小鼠中进行结肠镜引导下钳取活检并实时追踪伤口闭合过程的操作步骤。此外，还提供了用于对伤口床进行组织学、免疫组织化学及分子学分析的组织制备方法。
本文内容
摘要
摘要
研究胃肠道（GI）系统疾病时，了解急性损伤反应以及伤口愈合过程中发生的组织和细胞变化至关重要。小鼠结肠钳夹活检模型是定义这些过程的有效工具，此外还可用于研究肠道腔内容物（如微生物）与结肠之间的相互作用。然而，伤口的诱导以及以可靠方式随时间追踪伤口闭合情况可能具有挑战性。而且，为了充分分析组织学和分子层面的变化，组织制备和定向必须以标准化的方式进行。本文介绍了一种详细的方法，通过重复结肠镜检查来描述活检诱导的损伤及伤口闭合的监测。该方法可确保对伤口大小进行一致且可重复的测量，能够采集伤口床组织用于分子分析，并在组织切片后实现对伤口床的可视化观察。成功实施这些技术，有助于开展针对结肠内急性损伤反应、伤口愈合以及腔内-宿主相互作用的研究。
引言
胃肠道（GI）是一个复杂的器官系统 ，因其具有多种功能、多种宿主细胞类型（例如上皮细胞、免疫细胞、基质细胞等）以及数以万亿计的微生物。鉴于其复杂性，胃肠道疾病通常涉及上述所有因素之间的相互作用。例如，炎症性肠病（IBD）与胃肠道内炎症与缓解周期相关，涉及炎性细胞的活化、菌群失调以及上皮修复1,2,3,4,5,6,7。建立合适的模型系统以研究IBD及其他胃肠道炎症性疾病，对于阐明疾病的发病机制至关重要。目前已有多种模型用于研究IBD的发病机制，包括基因工程小鼠以及在啮齿类动物中使用葡聚糖硫酸钠（DSS）等化学物质8,9,10。这些模型的局限性包括难以精确控制炎症的诱导过程，以及在评估伤口愈合方面存在困难。因此，开发能够模拟IBD发病机制某些方面的替代方法，可能有助于新疗法的研发。....
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方案
本研究所述所有操作程序均经威尔康奈尔医学院机构动物照护与使用委员会批准。” 更新为：“本研究所述所有操作程序均经威尔康奈尔医学院和石溪大学机构动物照护与使用委员会批准。
1. 结肠镜检查与伤口诱导
- 预先组装内窥镜的各个部件，首先将1.9 mm刚性内窥镜插入鞘管中（图1A-B）。使用提供的管路将气泵（用于提供结肠充气）连接至鞘管左侧工作通道旁的气体阀图1C).
注意：尽管此处描述的镜头为0°，但也可使用30°镜头完成此操作。 - 确保工作通道处于打开状态，将3 Fr活检钳经工作通道插入，并向前推进至鞘管末端（同时确保其不伸出鞘管外）图1C）。根据制造商的说明，将组装好的内窥镜连接至光源和视频成像设备。
- 在诱导室中使用5%异氟烷与氧气对小鼠进行麻醉。随后将小鼠转移至带有加热系统（防止低体温）的内镜检查平台，仰卧位固定，并通过鼻罩以2%异氟烷与氧气维持麻醉状态。在小鼠眼睛处涂抹兽医用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。通过轻捏后肢足部检测反射，确认小鼠已完全麻醉。
注：任何品系或任一性别 小鼠可采用此技术；然而，建议小鼠至少为8周龄，以便体型足够大，适合进行该操作。 <....
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结果
进行活检所需的微小器械（镜头、套管、活检钳）如图1所示，并附有这些组件正确组装的指示。 图2展示了伤口床可接受视野的代表性图像，以准确量化伤口床的大小及伤口闭合速率。 图3A显示了伤口床离体观察的示例图像，包括伤口床周界的标记（指示用于分子分析的组织切除区域）以及组织切开位置的指示，以便在切片后能够清晰观察伤口床。 图3B展示了苏木精-伊红（H&E）染色切片的代表性图像，其中可清晰观察到伤口床。 补充视频1提供了从小鼠结肠内部观察活检过程的视角。
图1.......
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讨论
在该模型中，为了有效评估伤口闭合速率，确保活检的一致性和准确性以及伤口尺寸测量的精确性至关重要。因此，应采取多项措施以确保操作正确实施。首先，活检的深度既不能过浅也不能过深。若过浅，则无法提供足够的观察窗口来评估伤口闭合情况。图2展示了第0天理想的活检深度和大小。请注意伤口床周围黏膜与伤口床下方残留组织之间的清晰界限（图2）。若活检过深，则可能发生穿孔，导致小鼠无法用于评估。在第0天活检后进行充气时，若小鼠腹部明显膨胀，则表明已发生穿孔，该小鼠不应继续用于实验，应实施安乐死。为提高一致性，建议由同一操作人员完成同一研究中的所有活检操作。其次，必须确保活检部位位于直肠内，而非更近端的结肠区域。由于直肠壁比结肠近端区域更厚，因此在此处操作可显著降低穿孔风险。应在鞘管外侧距末端0.5 cm处做一标记，并仅将内窥镜插入至该标记处，以确保活检钳不会超出直肠范围。第三，在活检过程中以及观察伤口床时，维持适当的充气量至关重要。活检期间，若结肠过度膨胀，则肠壁会过于紧张，导致可用于取样的黏膜不足。因此，建议操作内窥镜者不要将食指压在气.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了克罗恩病和结肠炎基金会（D.C.M.）以及纽约克罗恩病基金会（D.C.M. 和 A.J.D.）资助。 作者感谢卡门·费拉拉女士（Ms. Carmen Ferrara）协助制作本文的视频配套资料。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 活检钳，3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview 塔式系统 | Karl Storz | contact company | |
| 检查鞘，9 Fr，套件 | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins 望远镜，0'，1.9 mm × 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| 异氟烷 | Covetrus | 2905 | |
| 亚甲蓝 | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| 微型虹膜剪刀 | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | 可从以下网址免费下载的软件：https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 水族泵 | Amazon | N/A | |
| 带 #10 刀片的手术刀 | Hill-Rom | 372610 |
参考文献
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22
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