Colonoscopische geleide pinch-biopsieën bij muizen uitvoeren en daaropvolgende weefselveranderingen evalueren
Summary
Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de procedure om colonoscopisch geleide knijpbiopten bij muizen te induceren en wondsluiting in realtime te volgen. Daarnaast zijn er methoden voor de bereiding van weefsels voor histologische, immunohistochemische en moleculaire analyses van het wondbed.
Abstract
Inzicht in het weefsel en de cellulaire veranderingen die optreden in de acute letselrespons en tijdens het wondgenezingsproces is van het grootste belang bij het bestuderen van ziekten van het maagdarmkanaal (GI). Het murine colonic pinch biopsiemodel is een nuttig hulpmiddel om deze processen te definiëren. Bovendien kan het samenspel tussen darmluminantiegehalte (bijv. microben) en de dikke darm worden bestudeerd. Wondinductie en het vermogen om wondsluiting na verloop van tijd op een betrouwbare manier te volgen, kunnen echter een uitdaging zijn. Bovendien moeten weefselvoorbereiding en -oriëntatie op een gestandaardiseerde manier worden uitgevoerd om histologic en moleculaire veranderingen optimaal te ondervragen. Hier presenteren we een gedetailleerde methode die biopsie-geïnduceerde verwonding en de monitoring van wondsluiting door herhaalde colonoscopieën beschrijft. Er wordt een aanpak beschreven die zorgt voor consistente en reproduceerbare metingen van de wondgrootte, het vermogen om het wondbed te verzamelen voor moleculaire analyses en het wondbed te visualiseren bij het doorsneden van weefsels. Het vermogen om deze technieken met succes uit te voeren maakt studies mogelijk van de acute letselrespons, wondgenezing en luminaal-gastheer interacties binnen de dikke darm.
Introduction
Het maagdarmkanaal (GI) is een complex orgaansysteem gezien zijn meerdere functies, gastheerceltypen (bijv. epitheel, immuun, stromale, enz.) evenals biljoenen microben. In het licht van deze complexiteit brengen ziekten van het GI-kanaal vaak het samenspel van al deze factoren met zich mee. Inflammatoire darmziekten (IBD) worden bijvoorbeeld geassocieerd met cycli van ontsteking en remissie in het GI-kanaal, waarbij ontstekingscellen worden geactiveerd, dysbiose en epitheelherstel1,2,3,4,5,6,7. Het hebben van geschikte modelsystemen om IBD en andere inflammatoire aandoeningen van het maagdarmkanaal te bestuderen, is van cruciaal belang voor het ophelderen van de pathogenese van de ziekte. Er bestaan verschillende modellen om IBD pathogenese te bestuderen, waaronder genetisch gemanipuleerde muizen en het gebruik van chemicaliën zoals dextran natriumsulfaat (DSS) bij knaagdieren8,9,10. Beperkingen van deze modellen omvatten een onvermogen om de inductie van ontstekingen nauwkeurig te beheersen, evenals moeilijkheden bij het evalueren van wondgenezing. Alternatieve methoden om aspecten van IBD-pathogenese na te bootsen, kunnen nuttig zijn voor het ontwikkelen van therapieën.
Colonoscopisch geleide pinch biopsieën bij muizen bieden een nuttig modelsysteem om de pathogenese van de ontstekingsreactie, wondgenezing en gastheer-microbe-interacties in de dikke darm te bestuderen. Deze aanpak werd voor het eerst gebruikt als een experimenteel hulpmiddel in 2009, dat zijn nut aantoonde voor het bestuderen van de acute ontstekingsreactie en wondgenezing in dedarmen 11. Latere studies gebruikten deze techniek om de rollen van verschillende signaleringsroutes en de darmmicrobiota te evalueren, in colonische wondgenezing11,12,13,14,15,16,17,18. Meer recentelijk gebruikte onze groep dit model om het belang van sfingosine-1-fosfaatsignalering en bacteriën in de acute respons op darmletsel19te onderzoeken. Hoewel nuttig, kan het technisch uitdagend zijn om colonoscopisch geleide knijpbiopten bij muizen uit te voeren en latere weefselveranderingen te evalueren. Perforatie van de darm kan bijvoorbeeld optreden bij inductie van letsel en het kan moeilijk zijn om consistente metingen van het wondbed door seriële colonoscopieën te garanderen. Bovendien kan het een uitdaging zijn om het colonweefsel goed te oriënteren om het wondbed te visualiseren voor histologische of immunohistochemische analyses. Hoewel er enige informatie bestaat over deze methoden18,20, belooft een nauwkeurige stapsgewijze beschrijving van deze technieken samen visuele hulpmiddelen om de betrouwbaarheid en het bredere nut van dit model te verbeteren. Hier presenteren we een gedetailleerde methode om colonoscopisch geleide knijpbiopsieën bij muizen uit te voeren, wondsluiting in de loop van de tijd te volgen en het weefsel voor te bereiden om histologic en moleculaire analyses van het wondbed mogelijk te maken. Het creëren van een standaardmethode om deze technieken uit te voeren kan het gebruik van dit model uitbreiden om eerder niet-onderzochte mediators te bestuderen die mogelijk belangrijk zijn voor GI-ontsteking en wondherstel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het waarborgen van consistente en nauwkeurige biopten en metingen van de wondgrootte zijn van het grootste belang bij het effectief evalueren van de snelheid van wondsluiting in dit model. Daarom moeten verschillende maatregelen worden genomen om erop te vertrouwen dat de procedures correct worden uitgevoerd. Ten eerste mag de diepte van de biopsie niet te ondiep of diep zijn. Als het te ondiep is, zal er niet voldoende venster zijn om wondsluiting te evalueren. Figuur 2 toont een optimale b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van Crohn’s and Colitis Foundation (D.C.M) en New York Crohn’s Foundation (D.C.M. en A.J.D.). De auteurs danken mevrouw Carmen Ferrara voor hulp bij het maken van de videobegeleiding van dit artikel.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
