פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים
Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o– תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.
Abstract
מחקר fDrug לטיפול בדלקות ריאות מתקדם לקראת חיזוי במודלים מוליטרו של מורכבות גבוהה. הנוכחות הרב-גפית של חיידקים במודלים של ריאות יכולה להתאים מחדש את הסידור האפיתל, בעוד תאים חיסוניים לתאם תגובה דלקתית נגד החיידקים בסביבה מיקרו. בעוד במודלים vivo היו הבחירה לבדיקת אנטי-זיהומים חדשים בהקשר של סיסטיק פיברוזיס, הם עדיין לא לחקות במדויק את תנאי vivo של מחלות כאלה בבני אדם ואת תוצאות הטיפול. מורכבים במודלים מולכיים של דרכי הנשימה הנגועות המבוססות על תאים אנושיים (אפיתל סיפונות וקרופאגים) ופתוגנים רלוונטיים יכולים לגשר על הפער הזה ולהקל על תרגום של נוגדי זיהומים חדשים למרפאה. למטרות כאלה, מודל תרבות שיתופית של סיסטיק פיברוזיס האנושית סימפונות קו תא אפיתל CFBE41o– ו THP-1 מונוציט נגזר מקרופאגים הוקמה, מחקה זיהום של רירית הסימפונות האנושית על ידי P. aeruginosa בממשק אוויר נוזלי (ALI) תנאים. מודל זה מוגדר בשבעה ימים, ואת הפרמטרים הבאים מוערכים בו זמנית: שלמות מחסום אפיתל, טרנסמיג מקרופאג,הישרדות חיידקים, ודלקת. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת חזקה ותשובת להערכת יעילות התרופה ותגובות מארחות שיכולות להיות רלוונטיות לגילוי נוגדי זיהומים חדשים ולייטוב אספקת האירוסול שלהם לריאות.
Introduction
פסאודומונס aeruginosa הוא פתוגן רלוונטי סיסטיק פיברוזיס (CF) שתורם ליקוי רקמת ריאה1. הייצור של פוליסכרידים, כגון אלגינט ואקסופוליסכרידים אחרים, מתאם את התקדמות המחלה, מה שמוביל לדבקות חיידקים עקשנית, מגביל את אספקת אנטיביוטיקה לחיידקים ומגן על החיידקים מפני המערכת החיסוניתהמארחת 2. המעבר של P. aeruginosa מהשלב פלנקטוני להיווצרות biofilm הוא נושא קריטי בהקשר זה, גם להקל על המופע של סובלנות לאנטיביוטיקה.
בהקשר של CF, העכבר שימש בעיקר כמודל. עכברים, עם זאת, לא באופן ספונטני לפתח מחלה זו עם המבוא של מוטציות CF3. רוב פיתוח הביופילם החיידקי ותרופות רגישות מחקרים בוצעו על משטחים abiotic, כגון צלי פטרי. עם זאת, גישה זו אינה מייצגת את מורכבות vivo. לדוגמה, מחסומים ביולוגיים חשובים נעדרים, כולל תאים חיסוניים, כמו גם אפיתל ריר. למרות P. aeruginosa הוא רעיל למדי לתאי אפיתל, כמה קבוצות הצליחו לטפח מוקדם P. aeruginosa biofilm עם תאים הסימונכיאליים האנושיים. תאים אלה מקורם חולי סיסטיק פיברוזיס עם מוטציה CFTR (CFBE41o– תאים)4 ומותר להעריך יעילותאנטיביוטית 5 או להעריך את התיקון של חלבון CFTR במהלךזיהום 6. מודל כזה הוצג כדי לשפר את יכולת החיזוי של יעילות התרופה, בנוסף לאפשר אפיון של בעיות עם תרופות שנכשלו בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח תרופות7.
עם זאת, בריאה, אפיתל הריר חשוף לאוויר. יתר על כן, תאים חיסוניים נוכחים בדרכי הנשימה, כמו מקרופאגים רקמה, לשחק תפקיד חיוני נגד פתוגנים בשאיפה אוחלקיקים 8. מקרופאגים נודדים דרך שכבות התא השונות כדי להגיע לומן הסיפונות ולהילחם בזיהום. יתר על כן, תרופות בשאיפה גם צריך להתמודד עם הנוכחות של ריר כמרכיב נוסף שאינו תאי של מחסום דם האווירריאתי 9. ואכן, פותחו מספר תלת מימד מורכבים (תלת מימד) בדגמי מבחנה, במטרה להגדיל את הרלוונטיות של vivo. מערכות שיתוף תרבות לא רק להגדיל את המורכבות של מערכות חוץ חוץ עבור גילוי סמים, אלא גם לאפשר ללמוד אינטראקציות תא. מורכבות כזו טופלה במחקרים על הגירהמקרופאג 10, שחרור פפטידים מיקרוביאליים על ידינויטרופילים 11, התפקיד שלריר בזיהום 9, ואת התגובה תא אפיתל לנזקמוגזם 12. עם זאת, אמין CF נגוע במודל במבחנה הכולל את המוטציה הגנטית ב CF, כי הוא חשוף לאוויר (מצב פיזיולוגי מוגבר), ומשלב תאים חיסוניים עדיין חסר.
כדי לגשר על הפער הזה, אנו מתארים פרוטוקול לתרבות תלת-מית-מית-מית-אנושית יציבה של דרכי הנשימה הנגועות. המודל מורכב של תאי אפיתל סימונכיים CF אנושיים מקרופאגים, נגוע P. aeruginosa ומסוגל לייצג מחסום דיפוזיה ואימונולוגית. במטרה לבחון נוגדי זיהומים בתפוקה גבוהה למדי, תרבות משותפת זו הוקמה על קרום מסנן חדיר של תוספות צלחת באר, באמצעות שני קווי תאים אנושיים: CFBE41o– ו מקרופאגים נגזר THP-1 מונוציט. יתר על כן, כדי ללמוד בסופו של דבר את התצהיר שלתרסיס נגד זיהומים 13, המודל הוקם בממשק האוויר נוזלי (ALI) ולא תנאים מכוסים נוזלי (LCC).
כפי שאנו מדווחים כאן, מודל זה מאפשר להעריך לא רק הישרדות חיידקים על טיפול אנטיביוטי, אלא גם ציטוקסיות תא, שלמות מחסום אפיתל, טרנסמיג מקרופאג, ותגובות דלקתיות, שהם פרמטרים חיוניים לפיתוח תרופות.
פרוטוקול זה משלב שני סוגי תאים רלוונטיים לטיפול בשאיפה של דרכי הנשימה הריאתיות: מקרופאגים ואפיליום סימפונות CF. תאים אלה נזרעים משני צדי המתוספה לתמיכה חדיר, ומאפשרים חשיפה לתא לאוויר (הנקרא תנאי ממשק נוזלי אוויר (ALI). תרבות זו של תאים מארחים נגועה לאחר מכן P. aeruginosa. שני קווי התא המארחים הם ממוצא אנושי: תאי האפיתל מייצגים את האפיתל הסימפונת סיסטיק פיברוזיס, עם מוטציה בערוץ CF (CFBE41o–), ואת THP-1114 תאים הם קו תא מאופיין היטב דמוי מקרופאג. שכבת אפיתל confluent מותרת תחילה ליצור בצד העליון של מותב צלחת באר לפני תאים כמו מקרופאג מתווספים לתא הנגדי. לאחר שהתרבות ההתופת הוקמה ב-ALI, המערכת מחוסנת עם P. aeruginosa בצד apical. מערכת זו נגועה שיתוף תרבות משמש לאחר מכן כדי להעריך את היעילות של אנטיביוטיקה, למשל tobramycin. נקודות הקצה הבאות מנותחות: שלמות מחסום אפיתל במונחים של התנגדות חשמלית טרנסאפיתליאלית (TEER), הדמיה של תא תא ותאי-חיידקים אינטראקציות על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM), הישרדות חיידקים על ידי ספירה של יחידות יוצרי מושבה (CFU), הישרדות תאי מארח (cytotoxicity) ושחרור ציטוקינה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור תרבית 3D של דרכי הנשימה הנגועות, המהווה על ידי סיסטיק פיברוזיס הסימפונת הסימפונת קו תא CFBE41o- ואת קו תא מקרופאג מונוציט אנושי נגזר THP-1. הפרוטוקול מאפשר הערכה של שלמות מחסום אפיתל, תרדת מקרופאג, הישרדות חיידקים, ודלקת, שהם פרמטרים חשובים בעת בדיקת יעילות התרופה ותגוב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו קיבלה מימון מתכנית HORIZON 2020 של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי, והדגמה תחת הסכם מענק מס ‘ 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA – עיצוב, ופיתוח של ננו-תרופות מתקדמות כדי להתגבר על מחסומים ביולוגיים ולטייסת במחלות קשות. אנו מודים לד”ר אנה קוסטה וד”ר ג’ני Juntke על התמיכה הגדולה על הפיתוח של התרבות ההפוכת, אולגה הרטוויג, על האיור המדעי, אניה Honecker, עבור ELISA assays, פטרה König, יאנה Westhues וד”ר קיארה דה רוסי על התמיכה בתרבות התא, ניתוח, ומיקרוסקופיה. אנחנו גם מודים לצ’לסי ת’ורן על הגהה של כתב היד שלנו.
Materials
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | – | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o– cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution – A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis – where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O’Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -. K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
