Summary

П. аэругиноза Зараженная 3D сокультура бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов при воздушно-жидком интерфейсе для доклинической оценки антиинфекционных элементов

Published: June 15, 2020
doi:

Summary

Мы описываем протокол для трехмерной модели совместной культуры инфицированных дыхательных путей, с использованием CFBE41o клеток, макрофагов THP-1 и Pseudomonas aeruginosa, установленной на воздушно-жидком интерфейсе. Эта модель предоставляет новую платформу для одновременного тестирования эффективности антибиотиков, функции эпителиального барьера и воспалительных маркеров.

Abstract

FDrug исследования для лечения легочных инфекций прогрессирует в направлении прогностических в пробирке модели высокой сложности. Многогранное присутствие бактерий в моделях легких может пере адаптировать эпителиальное расположение, в то время как иммунные клетки координируют воспалительный ответ против бактерий в микросреде. В то время как in vivo модели были выбор для тестирования новых анти-инфекционных в контексте муковисцидоза, они до сих пор не точно имитировать in vivo условия таких заболеваний у людей и результаты лечения. Сложные в пробирке модели инфицированных дыхательных путей на основе клеток человека (бронхиальные эпителиальные и макрофаги) и соответствующие патогенные микроорганизмы могли бы преодолеть этот разрыв и облегчить перевод новых противоинфекционных средств в клинику. Для этих целей была создана модель совместной культуры человеческого муковисцидоза бронхиальной эпителиальной клеточной линии CFBE41o и макрофагов THP-1, полученных из моноцитов, имитирующих инфекцию человеческой бронхиальной слизистой P. aeruginosa в условиях воздушно-жидкого интерфейса (АЛИ). Эта модель настроена в течение семи дней, и одновременно оцениваются следующие параметры: целостность эпителиального барьера, трансмиграция макрофага, выживание бактерий и воспаление. Настоящий протокол описывает надежную и воспроизводимую систему оценки эффективности лекарств и реакции хозяев, которая может иметь отношение к обнаружению новых противоинфекционных препаратов и оптимизации их доставки аэрозолей в легкие.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa является соответствующим патогеном в муковисцидоз (CF), который способствует нарушению легочной ткани1. Производство полисахаридов, таких как альгинат и другие слизистые экзополисахариды, координирует прогресс заболевания, что приводит к цепкой бактериальной приверженности, ограничивает доставку антибиотиков бактериям и защищает бактерии от иммунной системы хозяина2. Переход P. aeruginosa от планктонной стадии к образованию биопленки является критическим вопросом в этом контексте, также способствуя возникновению толерантности к антибиотикам.

В контексте CF мышь в основном используется в качестве модели. Мыши, однако, не спонтанно развивать это заболевание с введением мутаций CF3. Большинство исследований бактериальной биопленки и восприимчивости к лекарственным препаратам проводились на абиотических поверхностях, таких как петри. Однако этот подход не представляет сложности in vivo. Например, отсутствуют важные биологические барьеры, включая иммунные клетки, а также мукозальный эпителий. Хотя P. aeruginosa довольно токсичен для эпителиальных клеток, некоторым группам удалось совместно культивировать более раннюю биопленку P. aeruginosa с человеческими бронхиальными клетками. Эти клетки возникли из муковисцидоза пациентов с мутацией CFTR (CFBE41o клетки)4 и позволило оценить эффективность антибиотиков5 или оценить коррекцию белка CFTR во время инфекции6. Такая модель была показана для улучшения предсказуемости эффективности препарата, в дополнение к характеристике проблем с препаратами, которые не в более поздних стадиях разработки препарата7.

Однако в легких слизистый эпителий подвергается воздействию воздуха. Кроме того, иммунные клетки, присутствующие в дыхательных путях, как и макрофаги тканей, играют важную роль против вдыханных патогенов или частиц8. Макрофаги мигрируют через различные слои клеток, чтобы достичь бронхового просвета и бороться с инфекцией. Кроме того, вдыхаемые препараты также должны справиться с наличием слизи в качестве дополнительного неклеточного элемента легочного воздушно-кровавого барьера9. Действительно, было разработано несколько сложных трехмерных (3D) моделей in vitro, направленных на повышение релевантности in vivo. Системы совместного культуры не только повышают сложность систем in vitro для обнаружения лекарств, но и позволяют изучать взаимодействие клеток и клеток. Такая сложность была решена в исследованиях о миграции макрофагов10,высвобождении антимикробных пептидов нейтрофилами11,роли слизи в инфекции9,и эпителиальной клеточной реакции на чрезмерное повреждение12. Тем не менее, надежная CF-инфицированная модель in vitro, которая имеет генетическую мутацию в CF, которая подвергается воздействию воздуха (увеличенное физиологическое состояние), и интегрирует иммунные клетки, все еще отсутствует.

Чтобы преодолеть этот разрыв, мы описываем протокол стабильной 3D-культуры инфицированных дыхательных путей. Модель состоит из бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов человека, инфицированных P. aeruginosa и способных представлять как диффузный, так и иммунологический барьер. С целью тестирования противоинфекционных при достаточно высокой пропускной способности, эта со-культура была установлена на проницаемой мембране фильтра хорошо пластины вставки, используя две линии клеток человека: CFBE41o и THP-1 моноцитов производных макрофагов. Кроме того, чтобы в конечном итоге изучить осаждение аэрозолизированных противоинфекционных13, модель была создана на воздухе жидкости интерфейс (ALI), а не жидкости покрытые условия (LCC).

Как мы сообщаем здесь, эта модель позволяет оценить не только выживаемость бактерий при лечении антибиотиками, но и цитотоксичность клеток, целостность эпителиального барьера, трансмиграцию макрофагов и воспалительные реакции, которые являются существенными параметрами для разработки лекарств.

Этот протокол сочетает в себе два соответствующих типа клеток для ингаляционной терапии легочных дыхательных путей: макрофаги и CF бронхиальный эпителий. Эти клетки посеяны на противоположных сторонах проницаемых опорных вставок, что позволяет клеточному воздействию воздуха (так называемые условия воздушно-жидкого интерфейса (ALI). Эта со-культура клеток-хозяев впоследствии заражена P. aeruginosa. Обе линии клеток-хозяев имеют человеческое происхождение: эпителиальные клетки представляют муковисцидоз бронхиального эпителия, с мутацией на канале CF (CFBE41o), и THP-114 клетки хорошо характеризуется макрофагом, как клеточная линия. Слияние эпителиального слоя сначала допускается для формирования на верхней стороне хорошо пластины вставки до макрофагов, как клетки добавляются в противоположном отсеке. После того, как совместно культуры устанавливается в АЛИ, система прививается с P. aeruginosa на апсиа. Эта зараженная система совместной культуры затем используется для оценки эффективности антибиотика, например, тобрамицина. Анализируются следующие конечные точки: эпителиальная целостность барьера с точки зрения трансэпителиальной электрической резистентности (TEER), визуализация клеточно-клеточных и клеточно-бактериальных взаимодействий confocal лазерной сканирующей микроскопией (CLSM), бактериальное выживание путем подсчета колониообразующих единиц (CFU), выживаемость клеток-хозяев (цитотоксичность) и высвобождение цитокинов.

Protocol

1. Рост и дифференциация клеток в проницаемых опорных вставках Культивировать CFBE41o- в колбе T75 с 13 м Л минимальной необходимой среды (MEM), содержащей 10% фетальной сыворотки икры (FCS), 1% несущественных аминокислот и 600 мг/л глюкозы при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 атмосферы. Доб…

Representative Results

На рисунке 1A показана морфология результирующей сокультуры бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов человека после роста на 24 ч на апкической и басотераальной стороне проницаемых опор, соответственно. Целостность эпителиального барьера показана более высоким …

Discussion

В настоящем документе описывается протокол для 3D-культуры инфицированных дыхательных путей, образованной человеческой муковисцидоз бронхиальной эпителиальной клеточной линии CFBE41o- и человека моноцитов производных макрофаг клеточной линии THP-1. Протокол позволяет оценить целостност?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа получила финансирование из Программы Европейского союза «ГОРИЗОНТ 2020» по исследованиям, технологическим разработкам и демонстрации в соответствии с грантовым соглашением No 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA – проектированием и разработкой передовых наномедицин для преодоления биологических барьеров и лечения тяжелых заболеваний. Мы благодарим д-ра Ана Коста и д-ра Дженни Juntke за большую поддержку в развитии совместно-культуры, Ольга Хартвиг, для научной иллюстрации, Аня Хонеккер, для анализа ELISA, Петра Кёниг, Яна Westhues и д-р Кьяра Де Росси за поддержку в области клеточной культуры, аналитики и микроскопии. Мы также благодарим Челси Торн за то, что она корректив нашу рукопись.

Materials

Accutase Accutase AT104
Ampicillin Carl Roth, Germany HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer OLS Omni Life Sciences
CellTrace Far Red Thermo Fischer C34564
Centrifuge Universal 320R Hettich, Germany 1406
CFBE41o cells 1. Gruenert Cell Line Distribution Program
2. Sigma-Aldrich
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert
2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm World Precision Instruments, Sarasota, USA STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM Leica, Mannheim, Germany TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits Affymetrix eBioscience, USA 15541037
Cytokines Panel I and II LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). 740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche 11644793001
D-(+) Glucose Merck 47829
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fischer D1306
Epithelial voltohmmeter World Precision Instruments, Sarasota, USA EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile Corning, Amsterdam, Netherlands 353181
Fetal calf serum Lonza, Basel, Switzerland DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 Invitrogen A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle Roche, Mannheim, Germany 10127230001
LB broth Sigma-Aldrich, Germany L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium) Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. 11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. 11140050
P. aeruginosa strain PAO1 American Type Culture Collection 47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP American Type Culture Collection 10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% EMS DIASUM 15710-S
Phosphate buffer solution buffer Thermo Fischer 10010023
Petri dishes Greiner 664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma, Germany P8139-1MG
Precision Cover Glasses ThorLabs CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody BD Transduction Laboratories 610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK 11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) Normax, Portugal 5058561
Saponin Sigma-Aldrich, Germany S4521
T75 culture flasks Thermo Fischer 156499
THP-1 cells Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt Sigma T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fischer 25300054
Tween80 Sigma-Aldrich, Germany P1754

References

  1. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
  2. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  3. Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  4. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
  5. Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
  6. Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a., Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
  7. Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
  8. Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
  9. Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
  10. Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
  11. Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  12. Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
  13. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
  14. Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
  15. Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
  16. Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
  17. Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
  18. Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
  19. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
  20. Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
  21. Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  22. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
  23. Daigneault, M., Preston, J. a., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  24. Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution – A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
  25. Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis – where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
  26. Ehrhardt, C., Collnot, E. -. M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
  27. Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O’Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
  28. Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
  29. Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
  30. Ho, D. -. K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).

Play Video

Cite This Article
Montefusco-Pereira, C. V., Horstmann, J. C., Ebensen, T., Beisswenger, C., Bals, R., Guzmán, C. A., Schneider-Daum, N., Carvalho-Wodarz, C. d. S., Lehr, C. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp. (160), e61069, doi:10.3791/61069 (2020).

View Video