Extraction rapide et rentable de l’ARN du tissu pancréatique rat
Summary
La pureté et l’intégrité de l’ARN isolé est une étape essentielle dans les tests dépendants de l’ARN. Ici, nous présentons une méthode pratique, rapide et peu coûteuse pour extraire l’ARN d’une petite quantité de tissu pancréatique intact.
Abstract
Indépendamment de la méthode d’extraction, l’extraction optimisée de l’ARN des tissus et des lignées cellulaires se fait en quatre étapes : 1) homogénéisation, 2) dénaturation efficace des protéines de l’ARN, 3) l’inactivation de la ribonucléase, et 4) l’élimination de la contamination de l’ADN, des protéines et des glucides. Cependant, il est très laborieux de maintenir l’intégrité de l’ARN quand il ya des niveaux élevés de RNase dans le tissu. L’autolyse spontanée rend très difficile d’extraire l’ARN du tissu pancréatique sans l’endommager. Ainsi, une méthode pratique d’extraction d’ARN est nécessaire pour maintenir l’intégrité des tissus pancréatiques pendant le processus d’extraction. Une étude expérimentale et comparative des protocoles existants a été réalisée en obtenant 20-30 mg de tissus pancréatiques de rat en moins de 2 minutes et en extrayant l’ARN. Les résultats ont été évalués par électrophorèse. Les expériences ont été réalisées trois fois pour la généralisation des résultats. L’immersion du tissu pancréatique dans le réactif de stabilisation de l’ARN à -80 °C pendant 24 h a donné un ARN à haute intégrité, lorsque le réactif d’extraction de l’ARN a été utilisé comme réactif. Les résultats obtenus étaient comparables aux résultats obtenus à partir de kits commerciaux avec fixations de colonne de spin.
Introduction
Les données génétiques structurelles peuvent être transcrites à un produit fonctionnel par l’expression des gènes. L’analyse de l’ARN est utilisée pour découvrir des différences dans l’expression des gènes dans différentes conditions. Il existe un certain nombre de méthodes pour extraire les acides nucléiques comme suit : guanidinium thiocyanate, extraction par phénol-chloroforme, chromatographie à base de cellulose, extraction par matrices de silice, et anion-échange1,2.
Une détection adéquate de l’expression génique est influencée par l’intégrité de l’ARN isolé des tissus; par conséquent, il est essentiel d’évaluer l’intégrité de l’ARN isolé des tissus avant que d’autres tests ne soient effectués parce que des tests moléculaires complémentaires sur un ARN de mauvaise qualité peuvent compromettre les résultats des applications diagnostiques. Ainsi, l’ARN à haute intégrité est nécessaire pour les tests biologiques moléculaires avec différentes applications diagnostiques : RT-PCR quantitatif, micro-réseaux, test de protection ribonucléase, analyse de tache nordique, cartographie de l’ARN et construction de bibliothèque cDNA3,4.
L’ARN devient plutôt instable après avoir été longtemps conservé. Les longs fragments d’ARNm de plus de 10 ko sont particulièrement sensibles à la dégradation5,6. Ainsi, les chercheurs doivent tenir compte de divers facteurs qui influencent l’intégrité de l’ARN purifié. La pureté de l’ARN doit être protégée contre les RNases, les protéines, l’ADN génomique et la contamination par les inhibiteurs enzymatiques. En outre, le meilleur et acceptable rapport d’absorption de l’ARN aux UV (260/280) doit être dans la gamme de 1,8-2.0 avec une fragmentation minimale sur l’électrophorèse. Des techniques de laboratoire récemment développées ont permis aux scientifiques d’évaluer l’intégrité de l’échantillon d’analyse moléculaire plus pratiquement7,8.
Il est beaucoup plus difficile d’extraire l’ARN intact du tissu pancréatique que d’autres types de tissus en raison de la grande quantité de ribonucléases (RNases). Cependant, les méthodes d’extraction existantes, à savoir l’éjection rapide du tissu pancréatique de la cavité abdominale et l’homogénéisation à basse température pour entraver RNases, se sont avérées inefficaces7,8,9,10,11,12,13,14.
Le but de la présente étude expérimentale comparative est de modifier et de comparer les méthodes existantes pour déterminer les méthodes les plus efficaces. À cette fin, divers protocoles d’extraction de l’ARN ont été modifiés et comparés. Il visait spécifiquement à déterminer la méthode la moins coûteuse nécessitant une quantité minimale de tissu pancréatique.
Protocol
Representative Results
Discussion
En biologie moléculaire, il est essentiel d’obtenir un ARN de haute qualité. La présence des enzymes ribonucléase dans les cellules et les tissus dégrade rapidement l’ARN et rend l’extraction complexe. RNases sont des enzymes stables fonctionnant sans aucun co-facteur. De petites quantités de RNase sont suffisantes pour détruire l’ARN. Lorsque le tissu pancréatique du rat est retiré de la cavité abdominale, il est nécessaire de désinfecter les instruments chirurgicaux par des détergents solides, les …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La présente étude a été soutenue financièrement par l’Université des sciences médicales de Shiraz (subvention no 93-01-01-7178\03-07-2014). Nous remercions M. Zomorodian et M. Rostami du Département d’e-Learning en sciences médicales, de l’École virtuelle et du Centre d’excellence en e-Learning de l’Université des sciences médicales de Shiraz pour avoir modifié la vidéo.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
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