Estrazione rapida ed economica dell'RNA del tessuto pancreatico ratto
Summary
La purezza e l’integrità dell’RNA isolato è un passo vitale nei saggi dipendenti dall’RNA. Qui, presentiamo un metodo pratico, rapido ed economico per estrarre l’RNA da una piccola quantità di tessuto pancreatico non danneggiato.
Abstract
Indipendentemente dal metodo di estrazione, l’estrazione ottimizzata dell’RNA dei tessuti e delle linee cellulari viene effettuata in quattro fasi: 1) omogeneizzazione, 2) denaturazione efficace delle proteine da RNA, 3) inattivazione della ribonuclea e 4) rimozione della contaminazione da DNA, proteine e carboidrati. Tuttavia, è molto laborioso mantenere l’integrità dell’RNA quando ci sono alti livelli di RNase nel tessuto. L’autolisi spontanea rende molto difficile estrarre l’RNA dal tessuto pancreatico senza danneggiarlo. Pertanto, è necessario un metodo pratico di estrazione dell’RNA per mantenere l’integrità dei tessuti pancreatici durante il processo di estrazione. Uno studio sperimentale e comparativo dei protocolli esistenti è stato effettuato ottenendo 20-30 mg di tessuti pancreatici di ratto in meno di 2 minuti ed estraendo l’RNA. I risultati sono stati valutati per elettroforesi. Gli esperimenti sono stati effettuati tre volte per la generalizzazione dei risultati. Immergere il tessuto pancreatico nel reagente di stabilizzazione dell’RNA a -80 gradi centigradi per 24 h ha prodotto RNA ad alta integrità, quando il reagente di estrazione dell’RNA è stato utilizzato come reagente. I risultati ottenuti sono stati paragonabili ai risultati ottenuti da kit commerciali con attacchi di colonna di spin.
Introduction
I dati genetici strutturali possono essere trascritti in un prodotto funzionale attraverso l’espressione genica. L’analisi dell’RNA viene utilizzata per scoprire le differenze nell’espressione genica in diverse condizioni. Ci sono una serie di metodi per estrarre gli acidi nucleici come segue: guanidinium thiocyanate, estrazione tramite fenolo-cloroformio, cromatografia a base di cellulosa, estrazione da matrici di silice e scambio dianioni 1,2.
La corretta rilevazione dell’espressione genica è influenzata dall’integrità dell’RNA isolato dai tessuti; pertanto, è fondamentale valutare l’integrità dell’RNA isolato dai tessuti prima che vengono effettuati ulteriori test perché test molecolari complementari su RNA di bassa qualità possono compromettere i risultati dell’applicazione diagnostica. Pertanto, l’RNA ad alta integrità è necessario per i test biologici molecolari con diverse applicazioni diagnostiche: RT-PCR quantitativo, micro-array, analisi della protezione della ribonucleasi, analisi delle macchie settentrionali, mappatura dell’RNA e costruzione della libreria cDNA3,4.
L’RNA diventa piuttosto instabile dopo essere stato tenuto a lungo. Frammenti di mRNA lunghi oltre 10 kb sono particolarmente suscettibili alla degradazione5,6. Pertanto, i ricercatori devono considerare vari fattori che influenzano l’integrità dell’RNA purificato. La purezza dell’RNA deve essere protetta da RNases, proteine, DNA genomico e contaminazione da inibitori enzimatici. Inoltre, il miglior e accettabile rapporto di assorbimento tra RNA e UV (260/280) deve essere compreso nell’intervallo di 1,8-2,0 con frammentazione minima sull’elettroforesi. Tecniche di laboratorio sviluppate di recente hanno permesso agli scienziati di valutare l’integrità del campione di analisi molecolarepiù praticamente 7,8.
È molto più difficile estrarre l’RNA non danneggiato dal tessuto pancreatico rispetto ad altri tipi di tessuti a causa dell’elevata quantità di ribonucleasi (RNases). Tuttavia, i metodi di estrazione esistenti, vale a dire la rapida espulsione del tessuto pancreatico dalla cavità addominale e l’omogeneizzazione a basse temperature per ostacolare le RNases, si sono dimostrati inefficaci7,8,9,10,11,12,13,14.
Lo scopo dell’attuale studio sperimentale comparativo è quello di modificare e confrontare i metodi esistenti per determinare i metodi più efficienti. A tal fine, vari protocolli di estrazione dell’RNA sono stati modificati e confrontati. Era specificamente finalizzato a determinare il metodo meno costoso che richiede una quantità minima di tessuto pancreatico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nella biologia molecolare è fondamentale ottenere RNA di alta qualità. La presenza degli enzimi ribonucleasi nelle cellule e nei tessuti degrada rapidamente l’RNA e rende l’estrazione complessa. Le rule sono enzimi stabili che funzionano senza co-fattori. Piccole quantità di RNase sono adeguate per distruggere l’RNA. Quando il tessuto pancreatico del ratto viene rimosso dalla cavità addominale, è necessario disinfettare gli strumenti chirurgici con detergenti forti, sciacquarli accuratamente e metterli in forno per …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente dalla Shiraz University of Medical Sciences (Grant No. Ringraziamo il Sig. Eomorodian e il Sig. Rostami presso il Dipartimento di e-Learning in Scienze Mediche, Scuola Virtuale e Centro di Eccellenza in e-Learning, Università di Scienze Mediche di Shiraz per la modifica del video.
Materials
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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