مقايسات للتحقق من صحة مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز
Summary
مثبطات acetyltransferases هيستون (HATs، المعروف أيضا باسم lysine أستيل ترانسفيراليس)، مثل CBP/p300، هي العلاجات المحتملة لعلاج السرطان. ومع ذلك، هناك حاجة إلى أساليب صارمة للتحقق من صحة هذه المثبطات. ثلاث طرق في المختبر للتحقق من الصحة وتشمل المقايسات HAT مع أسيتيل ترانسفيرات المؤتلف، المناعية لاستيل هيستون في ثقافة الخلية، وChip-qPCR.
Abstract
Lysine acetyltransferases (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على histones والبروتينات الأخرى لتنظيم ديناميات الكروماتين والتعبير الجيني. تخضع الـ KATs، مثل CBP/p300، لتحقيق مكثف كأهداف علاجية بسبب دورها الحاسم في الأورام السرطانية المتنوعة. إن تطوير مثبطات جزيء صغير جديدة تستهدف وظيفة أسيتيلtransferase (HAT) من منتجات الطاقة المعدنية الكويتية (هات) يمثل تحدياً ويتطلب مقايسات قوية يمكنها التحقق من خصوصية وفاعلية المثبطات المحتملة.
توضح هذه المقالة خط أنابيب من ثلاث طرق توفر التحقق من صحة في المختبر الصارم لمثبطات HAT جديدة (HATi). وتشمل هذه الطرق اختبار اختبار أنبوب قبعة المقايسة, كروماتين فرط الacetylation تثبيط (ChHAI) اختبار, وChromatin المناعي-PCR الكمية (ChIP-qPCR). في مقايسة HAT، يتم احتضان HATs المؤتلف مع الهستونات في تفاعل أنبوب الاختبار، مما يسمح لالآستيل من بقايا ليسين محددة على ذيول الحجر. ويمكن منع هذا التفاعل بواسطة HATi ويمكن قياس المستويات النسبية من أسيتيل هينيستون محددة الموقع عن طريق المناعة. مثبطات محددة في قبعة المقايسة تحتاج إلى تأكيد في البيئة الخلوية.
يستخدم مقايسة ChHAI مناعيًا لفحص HATi رواية أن تخفيف فرط acetylation قوية من النغمات الناجمة عن مثبط deacetylase هيستون (HDACi). إضافة HDACi مفيد لأن مستويات القاعدية من أسيتيل هينيستون يمكن أن يكون من الصعب الكشف عن طريق المناعة.
ويقيس مقايستا هات وتشهاي التغيرات العالمية في أسيتيل الهيستون، ولكن لا تقدمان معلومات بشأن أسيتيل في مناطق جينية محددة. ولذلك، يتم استخدام ChIP-qPCR للتحقيق في آثار HATi على مستويات أستيل هيستون في العناصر التنظيمية الجينات. ويتم ذلك من خلال التحلل المناعي الانتقائي لمجمعات هيستون-دنا وتحليل الحمض النووي المنقى من خلال qPCR. معا، هذه المقايسات الثلاثة تسمح للتحقق الدقيق من خصوصية، قوة، وآلية العمل من رواية HATi.
Introduction
ليسين أستيل ترانسفيراديس (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على كل من البروتينات هيستون وغير هيستون1,2,3,4. كشفت الأبحاث الحديثة أن KATs ووظيفة الأسيتيل ترانسفيراز يمكن أن تعزز نمو الورم الصلب4،5،6،7،8،9. على سبيل المثال، بروتين الكريب الملزم (CBP)/p300 هما KATs البارالوجين التي تنظم العديد من مسارات الإشارات في السرطان2،3. CBP/p300 لديها جيدا تتميز هييتيلترانزفيراز (HAT) وظيفة وتحفيز هيستون 3 Lysine 27 أستيل (H3K27ac)2,4,5,10,11, علامة هامة لمعززات النشطة, مناطق المروج والنسخ الجيني النشط12,13,14. CBP/p300 بمثابة المنشطات المشاركة الحرجة Pro-growth signals pathways في الأورام الصلبة عن طريق تفعيل النسخ من أونكوجين من خلال أستيل من histyles وعوامل النسخ الأخرى4,9,15,16,17,18.9 نظرا لدورها في تطور الورم، CBP/p300 وغيرها من الـ KATs هي قيد التحقيق لتطوير مثبطات الرواية التي تمنع وظيفتها oncogenic4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 و GNE-049 تمثل محاولتين ناجحتين لتطوير مثبطات قوية ومحددة لCBP/p3004,9. ويجري حالياً فحص مثبطات إضافية لـ CBP/p300 وغيرها من الـ KATs.
ويجري الآن مسألة نوعية مثبطات KAT الموصوفة سابقا (KATi) في التشكيك، مع العديد من مثبطات الرياء الآثار المستهدفة وسوء توصيف21. ولذلك ، توصيف صارمة والتحقق من المرشحين المخدرات جديدة أمر ضروري لتطوير تحقيقات كيميائية عالية الجودة. المبينة هنا هي ثلاثة بروتوكولات التي تشكل خط أنابيب لفحص والتحقق بدقة من قوة وخصوصية رواية KATi ، مع التركيز بشكل خاص على تثبيط وظيفة HAT (HATi) من KATs. يستخدم CBP/p300 ومثبطاتها كأمثلة ، ولكن يمكن تكييف هذه البروتوكولات لغيرها من كاوت التي لها وظيفةHAT 7.
البروتوكول الأول هو في المختبر acetyltransferase (HAT) المقايسة التي تستخدم تنقية p300 وhistones في تفاعل أنبوب اختبار تسيطر عليها. هذا المقايسة بسيطة لأداء، هو فعالة من حيث التكلفة، ويمكن استخدامها لفحص المركبات في إعداد الإنتاجية المنخفضة، ولا تتطلب مواد مشعة. في هذا البروتوكول، يتم قياس p300 المؤتلفة lylyzes lysine acetylation على ذيول هيستون خلال فترة حضانة قصيرة ومستويات أسيتيل هيستون باستخدام إجراءات المناعة القياسية. يمكن إجراء التفاعل الأنزيمي في وجود أو عدم وجود مثبطات CBP/p300 لفحص المركبات التي تقلل من أستيلستون. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مقايسة HAT للتحقق مما إذا كانت المركبات الجديدة انتقائية لCBP/p300 من خلال تقييم نشاطها ضد غيرها من الكاتس المنقى، مثل PCAF. إن مقايسة HAT هي نقطة انطلاق ممتازة للتحقيق في مثبطات الرواية نظرًا لبساطتها ، وانخفاض تكلفتها ، والقدرة على تحديد فاعلية / انتقائية المانع. في الواقع، وغالبا ما يستخدم هذا البروتوكول في الأدب كشاشة في المختبر5،10. ومع ذلك، فإن مثبطات تحديد في اختبار HAT ليست فعالة دائما في ثقافة الخلية لأن رد فعل أنبوب الاختبار هو أبسط بكثير من نظام الخلايا الحية. ولذلك، فمن الضروري أن مزيد من تحديد خصائص مثبطات في تجارب ثقافة الخلية22،23.
البروتوكول الثاني في خط الأنابيب هو Chromatin Hyperacetylation تثبيط (ChHAI) المقايسة. هذه الخلية القائمة على المقايسة يستخدم مثبطات deacetylase هيستون (HDACi) كأداة لhyperacetylate الهستون في الكروماتين قبل المشاركة في الحضانة مع HATi24. يمكن أن يكون استيليه هينيلستون القاعدي منخفضًا في ثقافة الخلية ، مما يجعل من الصعب التحقيق فيه عن طريق التلطخ المناعي دون إضافة HDACi لزيادة الأسيتيلية. الغرض من مقايسة ChHAI هو تحديد رواية HATi التي يمكن أن تُثبِّت من الزيادة في أسيتيل هيستون الناجمة عن تثبيط HDAC. وتشمل مزايا هذا الفحص تكلفتها المنخفضة وسهولة الأداء النسبية واستخدام الخلايا في الثقافة، مما يوفر أهمية فسيولوجية أكثر من اختبار أنبوب الاختبار HAT. على غرار مقايسة HAT، يستخدم هذا البروتوكول مناعة معيارية لجمع البيانات.
تقدم مقايسات HAT و ChHAI بيانات حول قوة المركبات الجديدة لمنع أسيتيل الهيستون العالمي ، ولكنها لا توفر نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير هذه المركبات على التعديلات في مناطق جينومية محددة. ولذلك، فإن البروتوكول النهائي، Chromatin المناعية-الكمّي البوليميراز سلسلة التفاعل (ChIP-qPCR) هو تجربة ثقافة الخلية التي تحقق التفاعلات الحمض النووي البروتين في مناطق محددة من الجينوم. في بروتوكول ChIP، يتم ربط الكروماتين للحفاظ على تفاعلات الحمض النووي والبروتين. ثم يتم استخراج الكروماتين من الخلايا ويخضع مركب البروتينات الحمض النووي للمناعة الانتقائية للبروتين الذي يهم (على سبيل المثال، باستخدام جسم مضاد محدد لH3K27ac). ثم يتم تنقية الحمض النووي وتحليله باستخدام qPCR. على سبيل المثال، يمكن استخدام ChIP-qPCR لتحديد ما إذا كانت رواية HATi downregulates acetylation هينيستون في oncogenes الفردية، مثل Cyclin D125. في حين ChIP-qPCR هو أسلوب شائع يستخدم في هذا المجال، يمكن أن يكون من الصعب تحسين4،10،26. يوفر هذا البروتوكول تلميحات لتجنب المخاطر المحتملة التي يمكن أن تحدث أثناء تنفيذ إجراء ChIP-qPCR ويتضمن تدقيقات مراقبة الجودة التي يجب تنفيذها على البيانات.
عند استخدامها معا، وهذه البروتوكولات الثلاثة تسمح لتوصيف صارم والتحقق من صحة رواية HATi. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأساليب توفر العديد من المزايا لأنها سهلة الأداء، رخيصة نسبيا وتوفير البيانات عن الأسيتيل هيستون العالمية وكذلك الإقليمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ليسين أستيلtransferases (KATs) أسيتيلات عدة بقايا ليسين على ذيول هيستون وعوامل النسخ لتنظيم النسخ الجيني2,3. وقد كشف العمل في العقدين الماضيين أن KATs ، مثل CBP / p300 ، PCAF و GCN5 ، تتفاعل مع عوامل النسخ oncogenic وتساعد على دفع نمو الورم في العديد من أنواع الأورام الصلبة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من جيمس واستير كينغ برنامج البحوث الطبية الحيوية (6JK03 و 20K07)، وبرنامج أبحاث السرطان Bankhead-Coley (4BF02 و 6BC03)، ووزارة الصحة في فلوريدا، ومؤسسة فلوريدا لسرطان الثدي، ومركز السرطان الصحي UF. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر الدكتور زاكاري أوكينغ والدكتور أندريا لين على دعمهما خلال عملية النشر.
Materials
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | For all methods |
| 10 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | For cell culture of MCF-7 cells |
| 10 ul tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | For all Methods |
| 1000 ul tips | Corning | 4846 | For all Methods |
| 10X Glycine buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X Running Buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 10X TBST | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 12 well plate | Corning | 3513 | For Method 2 |
| 15 cm dish | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | For Method 3 |
| 15 ml conical tube | Santa Cruz Biotechnology | sc-200249 | For Methods 2 and 3 |
| 1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide | For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic. | ||
| 1X TBST with 5% milk | For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe. | ||
| 200 ul tips | Corning | 4844 | For all Methods |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for SDS sample buffer preparation |
| 4-20% polyacrylamide gel | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | For Methods 1 and 2 |
| 5X Assay buffer | For Method 1. See Table 1 for recipe. | ||
| 5X Passive lysis buffer | For Method 2. See Table 1 for recipe. | ||
| 6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO. |
| Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody | Cell Signaling Technology | 4771 | For Method 1 |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | for use in Method 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac) | Cell Signaling Technology | CST 8173 | antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac) | Cell Signaling Technology | CST 9675 | antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP |
| alpha tubulin antibody | Millipore Sigma | T5168 | For Method 2. Dilute 1:20,000 |
| Anacardic acid | Cayman Chemical | 13144 | For Method 1 |
| anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody | Cell Signaling Technology | 7076 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 |
| anti-rabbit IgG secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000 |
| Autoradiography film | MIDSCI | BX810 | For Methods 1 and 2 |
| Belly Dancer Rotating Platform | Stovall Life Science Incorporated | not available | For Methods 1 and 2 |
| Bovine Calf Serum (BCS) | HyClone | SH30072.03 | cell culture media |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | for buffer preparation |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for SDS sample buffer preparation |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | For buffer preparation |
| cell scraper | Millipore Sigma | CLS3010 | For Method 3 |
| ChIP dilution buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| ChIP Elution Buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Complete DMEM for MCF-7 Cells | For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Covaris 130 µl microTUBE | Covaris | 520045 | Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator for use in Method 3 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 41639 | for drug dilution and vehicle control treatment |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | for SDS sample buffer preparation |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | cell culture media |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | for buffer preparation |
| Example transfer tank and transfer apparatus | Bio-rad | 1704070 | For Methods 1 and 2 |
| EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit | Millipore Sigma | 17-10086 | For Method 3 |
| FK228 (Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8775 | for cell fixation |
| glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | For buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for buffer preparation |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | for buffer preparation |
| High salt wash buffer | For Method 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | for buffer preparation |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | For Methods 1 and 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | for buffer preparation |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | For buffer preparation |
| LiCl wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Low salt wash buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Magnetic Separator | Promega | Z5341 | For use in Method 3 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | For buffer preparation |
| Mini gel tank | Invitrogen | A25977 | For Methods 1 and 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO. |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | for buffer preparation |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-100 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| Normal Rabbit IgG | Bethyl Laboratories | P120-101 | Control rabbit antibody for use in Method 3 |
| Nuclei swelling buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| PCR Cleanup Kit | Qiagen | 28104 | For use in Method 3 |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | cell culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For Methods 2 and 3 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | 80635 | for buffer preparation |
| powdered milk | Nestle Carnation | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 200 for western blot transfer | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Power Pac 3000 for SDS gel running | Bio-rad | For Methods 1 and 2 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher | 26616 | For Methods 1 and 2 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | PI8340 | for use in Method 3 |
| Protein A Magentic Beads | New England BioLabs | S1425S | For use in Method 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | For use in Method 3 |
| PTC-100 Programmable Thermal Controller | MJ Research Inc. | PTC-100 | For Method 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | For Methods 1 and 2 |
| Recombinant H3.1 | New England BioLabs | M2503S | for use in Method 1 |
| Recombinant p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | for use in Method 1 |
| SAHA (Vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| SDS lysis buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Sodium Azide | Fisher Scientific | 26628-22-8 | For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | for buffer preparation |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | for buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71725 | for SDS sample buffer preparation |
| Standard Heatblock | VWR Scientific Products | MPN: 949030 | For Methods 1 and 2 |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5417R | For all methods |
| TE buffer | For Method 3. See Table 1 for recipe. | ||
| Transfer buffer | For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | HDAC Inhibitor for use in Method 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | for buffer preparation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | for buffer preparation |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | for buffer preparation in Methods 1 and 2 |
| X-ray film processor | Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. | SRX-101A | For Methods 1 and 2 |
References
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
- Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
- Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
- Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. 癌症研究. 77 (20), 5564-5575 (2017).
- Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
- Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
- Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
- Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
- Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. 癌症研究. 74 (6), 1870-1880 (2014).
- Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
- Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
- Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
- Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
- Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
- Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), 054702 (2019).
- Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
- Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2020).
- Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , (2004).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
- Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
- Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
- Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
- Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
- ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020)
- Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
- Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute – University of Queensland Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020)
- Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
- Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
- Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
- Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
- Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
- Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. 癌症研究. 61 (3), 931-934 (2001).
- Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
- Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).
