Analisi per la convalida degli inibitori dell'acetiltransferasi di Histone

Summary

Gli inibitori dei l’acetiltransferasi dell’istone (HAT, noto anche come lisina acetiltransferasi), come CBP/p300, sono potenziali terapie per il trattamento del cancro. Tuttavia, sono necessari metodi rigorosi per convalidare questi inibitori. Tre metodi in vitro per la convalida includono i saggi HAT con acetiltransferasi ricombinanti, l’immunoblotting per l’acetilazione degli istoni nella coltura cellulare e ChIP-qPCR.

Abstract

L’acetiltransferasi della lniina (KAT) catalizzare l’acetilazione dei residui di litina sugli istoni e su altre proteine per regolare la dinamica della cromatina e l’espressione genica. I T-A, come il CBP/p300, sono oggetto di un’intensa indagine in quanto obiettivi terapeutici a causa del loro ruolo critico nella tumorigenesi di diversi tipi di cancro. Lo sviluppo di nuovi inibitori di piccole molecole che prendono di mira la funzione dell’acetiltransferasi istone (HAT) dei KAT è impegnativo e richiede robusti saggi in grado di convalidare la specificità e la potenza dei potenziali inibitori.

Questo articolo descrive una pipeline di tre metodi che forniscono una rigorosa convalida in vitro per i nuovi inibitori HAT (HATi). Questi metodi includono un test tube di prova HAT, chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) saggio, e Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). Nel saggio HAT, i TEST ricombinanti vengono incubati con istoni in una reazione in provetta, consentendo l’acetilazione di specifici residui di litina sulle code istonese. Questa reazione può essere bloccata da un HATi e i livelli relativi di acetilazione istone specifica del sito possono essere misurati tramite immunoblotting. Gli inibitori identificati nel saggio HAT devono essere confermati nell’ambiente cellulare.

Il saggio ChHAI utilizza l’immunoblotting per lo screening per i nuovi HATi che attenuano la robusta iperacetilazione degli istoni indotti da un inibitore della deacetilase istonea (HDACi). L’aggiunta di un HDACi è utile perché i livelli basali di acetilazione istone può essere difficile da rilevare tramite immunoblotting.

I saggi HAT e ChHAI misurano i cambiamenti globali nell’acetilazione degli itoni, ma non forniscono informazioni sull’acetilazione in specifiche regioni genomiche. Pertanto, ChIP-qPCR viene utilizzato per studiare gli effetti di HATi sui livelli di acetilazione degli itoni a elementi regolatori genici. Ciò si ottiene attraverso l’immunoprecipizione selettiva dei complessi istone-DNA e l’analisi del DNA purificato attraverso il qPCR. Insieme, questi tre saggi permettono un’attenta convalida della specificità, della potenza e del meccanismo d’azione del nuovo HATi.

Introduction

L’acetiltransferasi di l’acetilsina (KAT) catalizzare l’acetilazione dei residui di lino sia sulle proteine istonesine che su proteine non istonese^1,2,3,4. Recenti ricerche rivelano che i KAT e la loro funzione di acetiltransferase possono promuovere la crescita del tumore^{solido 4,5,6,7,8,9}. Ad esempio, la proteina legante CREB (CBP)/p300 sono due KA paralogo che regolano numerose vie di segnalazione nel^{cancro 2,3}. CBP/p300 hanno una funzione acetiltransferasi istone ben caratterizzata (HAT) e catalizzare Histone 3 Lysine 27 acetilazione (H3K27ac)^2,4,5,10,11, un marcatore importante per potenziatori attivi, regioni promotori e trascrizione genica attiva^12,13,14. CBP/p300 servono come co-attivatori critici per le vie di segnalazione pro-crescita nei tumori solidi attivando la trascrizione degli oncogeni attraverso l’acetilazione degli istoni e altri fattori di trascrizione^{4,9,15,16,17,18}. A causa del loro ruolo nella progressione del tumore, CBP/p300 e altri KAT sono sotto inchiesta per lo sviluppo di nuovi inibitori che bloccano la loro funzione oncogenica^{4,5,6,7,8,9,18,19,20}. A-485 e GNE-049 rappresentano due tentativi riusciti di sviluppare inibitori potenti e specifici per CBP/p300^4,9. Ulteriori inibitori sono attualmente in fase di esame per CBP/p300 e altri KAT.

La qualità degli inibitori KAT precedentemente descritti (KATi) viene messa in discussione, con molti inibitori che mostrano effetti bersaglio e scarsa caratterizzazione²¹. Pertanto, una rigorosa caratterizzazione e convalida di nuovi farmaci candidati è essenziale per lo sviluppo di sonde chimiche di alta qualità. Qui delineati sono tre protocolli che formano una pipeline per lo screening e convalidano rigorosamente la potenza e la specificità del nuovo KATi, con un focus specifico sull’inibizione della funzione HAT (HATi) dei KAT. CBP/p300 e i loro inibitori sono utilizzati come esempi, ma questi protocolli possono essere adattati per altri KAT che hanno una funzione HAT⁷.

Il primo protocollo è un saggio di acetiltransferasi istone in vitro (HAT) che utilizza p300 ricombinante purificato e istoni in una reazione controllata in provetta. Questo saggio è semplice da eseguire, è conveniente, può essere utilizzato per lo screening dei composti in un ambiente a bassa produttività e non richiede materiali radioattivi. In questo protocollo, il ricombinante p300 catalizza l’acetilazione della lliina sulle code dell’istone durante un breve periodo di incubazione e i livelli di acetilazione dell’istone vengono misurati utilizzando procedure standard di immunoblotting. La reazione enzimatica può essere eseguita in presenza o assenza di inibitori CBP/p300 per lo screening di composti che riducono l’acetilazione istonea. Inoltre, l’analisi HAT può essere utilizzata per verificare se i nuovi composti sono selettivi per CBP/p300 valutando la loro attività rispetto ad altri KAT purificati, come PCAF. Il test HAT è un ottimo punto di partenza per studiare nuovi inibitori grazie alla sua semplicità, basso costo e alla capacità di determinare la potenza/selettività di un inibitore. Infatti, questo protocollo è spesso utilizzato nella letteratura come uno schermo in vitro^5,10. Tuttavia, gli inibitori identificati nel saggio HAT non sono sempre efficaci nella coltura cellulare perché una reazione in provetta è molto più semplice di un sistema cellulare vivente. Pertanto, è essenziale caratterizzare ulteriormente gli inibitori negli esperimenti di coltura^{cellulare 22,23}.

Il secondo protocollo in cantiere è il saggio Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI). Questo saggio basato su cellule utilizza inibitori della deacetilase istone (HDACi) come strumento per iperacetizzare gli istoni in cromatina prima della co-incubazione con un HATi²⁴. L’acetilazione dell’istone basale può essere bassa nella coltura cellulare, rendendo difficile la ricerca tramite immunoblotting senza l’aggiunta di un HDACi per aumentare l’acetilazione. Lo scopo del saggio ChHAI è quello di identificare nuovi HATi che possono attenuare l’aumento dell’acetilazione istonea causata dall’inibizione dell’HDAC. I vantaggi di questo saggio includono il suo basso costo, relativa facilità di esecuzione, e l’uso di cellule in coltura, che fornisce più rilevanza fisiologica rispetto al test tube HAT saggio. Simile al saggio HAT, questo protocollo utilizza l’immunoblotting standard per la raccolta dei dati.

I test HAT e ChHAI forniscono dati sulla potenza dei nuovi composti per inibire l’acetilazione degli itoni globali, ma non forniscono informazioni su come questi composti influenzano le modifiche in specifiche regioni genomiche. Pertanto, il protocollo finale, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) è un esperimento di coltura cellulare che studia le interazioni DNA-proteina in specifiche regioni del genoma. Nel protocollo ChIP, la cromatina è interconnessa per preservare le interazioni DNA-proteina. La cromatina viene quindi estratta dalle cellule e il complesso DNA-proteina subisce un’immunoprecipizione selettiva per la proteina di interesse (ad esempio, utilizzando un anticorpo specifico per H3K27ac). Il DNA viene quindi purificato e analizzato utilizzando qPCR. Ad esempio, ChIP-qPCR può essere utilizzato per determinare se un nuovo haTi downregulates histone acetylation at individual oncogenes, come Cyclin D1²⁵. Mentre ChIP-qPCR è una tecnica comune utilizzata nel campo, può essere difficile ottimizzare^4,10,26. Questo protocollo fornisce suggerimenti per evitare potenziali insidie che possono verificarsi durante l’esecuzione della procedura ChIP-qPCR e include controlli di qualità che devono essere eseguiti sui dati.

Se utilizzati insieme, questi tre protocolli consentono la rigorosa caratterizzazione e convalida del nuovo HATi. Inoltre, questi metodi offrono molti vantaggi perché sono facili da eseguire, relativamente a buon mercato e forniscono dati sull’acetilazione istonea globale e regionale.

Protocol

1. Analisi HAT in vitro Preparazione del bufferNOTA: vedere la tabella 1 per le ricette del buffer. Preparare 5x buffer di analisi e 6x Sodio Dodecyl Sulfate (SDS) e conservare a -20 gradi centigradi. Aliquot SDS in aliquots da 1 mL. Preparare 10x SDS gel in esecuzione buffer e 10x TBST e memorizzare a temperatura ambiente. Preparare il buffer di trasferimento 1x e conservarlo a 4 gradi centigradi.CAUTION: Controllare la scheda dati di sic…

Representative Results

L’analisi dell’acetiltransferasi dell’istone in vitro (HAT) può essere utilizzata per sondare i composti che inibiscono l’attività p300 HAT verso un substrato istonetico. Figura 1A fornisce uno schema sperimentale per il test HAT. L’acido anacardico, un noto HATi3,38, è stato utilizzato in questo saggio in un intervallo di concentrazione da 12.5-100 . A 100 M, l’acido anacardico regola p300 catalizzato l’acetilazione istonetica a …

Discussion

L’acetiltransferasi di l’acetilsione (KAT) acetilate diversi residui di litina sulle code dell’istoneo e sui fattori di trascrizione per regolare la trascrizione^{genica 2,3}. Il lavoro degli ultimi due decenni ha rivelato che i KAT, come CBP/p300, PCAF e GCN5, interagiscono con i fattori di trascrizione oncogenici e aiutano a guidare la crescita del tumore in diversi tipi di tumore solido^4,5,<sup…

Materials

1.5 ml tube	Fisher Scientific	05-408-129	For all methods
10 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3902	For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips	Fisher Scientific	02-707-454	For all Methods
1000 ul tips	Corning	4846	For all Methods
10X Glycine buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate	Corning	3513	For Method 2
15 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3903	For Method 3
15 ml conical tube	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide			For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk			For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips	Corning	4844	For all Methods
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	For Methods 1 and 2
5X Assay buffer			For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer			For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody	Cell Signaling Technology	4771	For Method 1
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)	Cell Signaling Technology	CST 8173	antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)	Cell Signaling Technology	CST 9675	antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody	Millipore Sigma	T5168	For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid	Cayman Chemical	13144	For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody	Cell Signaling Technology	7076	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film	MIDSCI	BX810	For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform	Stovall Life Science Incorporated	not available	For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)	HyClone	SH30072.03	cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	for buffer preparation
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for SDS sample buffer preparation
CDTA	Spectrum Chemical	125572-95-4	For buffer preparation
cell scraper	Millipore Sigma	CLS3010	For Method 3
ChIP dilution buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells			For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE	Covaris	520045	Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator	Covaris	S220	DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	for SDS sample buffer preparation
DMEM	Corning	10-013-CV	cell culture media
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus	Bio-rad	1704070	For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	Millipore Sigma	17-10086	For Method 3
FK228 (Romidepsin)	Cayman Chemical	128517-07-7	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8775	for cell fixation
glycerol	Fisher Scientific	BP229-1	For buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	G7126	for buffer preparation
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	for buffer preparation
High salt wash buffer			For Method 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore Sigma	WBKLS0500	For Methods 1 and 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	for buffer preparation
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	For buffer preparation
LiCl wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator	Promega	Z5341	For use in Method 3
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	For buffer preparation
Mini gel tank	Invitrogen	A25977	For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	for buffer preparation
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit	Qiagen	28104	For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X	Corning	30-002-CI	cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV	For Methods 2 and 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	for buffer preparation
powdered milk	Nestle Carnation		For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher	26616	For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	PI8340	for use in Method 3
Protein A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	For use in Method 3
Proteinase K	New England BioLabs	P8107S	For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller	MJ Research Inc.	PTC-100	For Method 1
PVDF Transfer Membrane	Millipore Sigma	IEVH00005	For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1	New England BioLabs	M2503S	for use in Method 1
Recombinant p300	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide	Fisher Scientific	26628-22-8	For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500	for buffer preparation
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock	VWR Scientific Products	MPN: 949030	For Methods 1 and 2
Table top centrifuge	Eppendorf	5417R	For all methods
TE buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A	Cayman Chemical	58880-19-6	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	for buffer preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	for buffer preparation
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor	Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.	SRX-101A	For Methods 1 and 2