פלסמודיום פאלציפארום תרבות המשחק וזיהום יתושים באמצעות האכלה מלאכותית של ממברנה
Summary
חקירות מפורטות על שלבי יתושים של טפילי מלריה הם קריטיים לתכנון אסטרטגיות חסימת שידור יעילות. פרוטוקול זה מדגים כיצד לתרבות ביעילות gametocytes זיהומיות ולאחר מכן להאכיל את המשחקים האלה יתושים כדי ליצור שלבי יתושים של P. falciparum.
Abstract
מלריה נותרה אחת הבעיות החשובות ביותר לבריאות הציבור, הגורמת לתחלואה ותמותה משמעותיות. מלריה היא מחלה המועברת על ידי יתושים המועברת באמצעות עקיצה מדבקת מיתוש אנופלס הנקבה. בקרת מלריה בסופו של דבר תיסתמך על מספר רב של גישות, הכוללות דרכים לחסום את ההעברה אל יתושים, דרך וממנה. כדי לחקור את שלבי היתושים של טפילי מלריה במעבדה, מיטבנו פרוטוקול לתרבות פלסמודיום פאלציפרום גמטוציטים מדבקים מאוד, שלב טפיל הנדרש להעברת הפונדקאי האנושי לווקטור היתושים. P. falciparum gametocytes בוגרים באמצעות חמישה שלבים שונים מבחינה מורפולוגית, אשר לוקח בערך 1-2 שבועות. תרבות Gametocyte המתוארת בפרוטוקול זה הושלמה ב 15 ימים והם זיהומיות יתושים מימים 15-18. פרוטוקולים אלה פותחו כדי לשמור על מחזור מתמשך של gametocytes מוסמך זיהום ולשמור על אספקה רציפה של שלבי יתושים של הטפיל. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה של תרבות gametocyte וכיצד להדביק יתושים עם טפילים אלה באמצעות מזינים קרום זכוכית.
Introduction
מלריה נגרמת על ידי טפילים פלסמודיום והוא מועבר המארחים החולייתיים שלהם באמצעות נשיכה זיהומית של יתושים אנופלס נקבה. על פי דו”ח ארגון הבריאות העולמי לשנת 2019( WHO), היו כ -405,000 מקרי מוות, מתוך סך של 228 מיליון מקרים של מלריה1. רוב מקרי המוות הקשורים למלריה התרכזו באזור אפריקה, במיוחד בקרב ילדים מתחת לגיל חמש. בעוד ששיעור השכיחות הכולל של מלריה ירד ברחבי העולם משנת 2010, בשנים האחרונות חלה ירידה ואסטרטגיות בקרה נוספות נחוצות בדחיפות כדי לחסל את המחלה.
שלבי דם א-מיניים מחזוריים של טפילים מלריה גורמים לפתוגנזה של מחלות ותת-קבוצה קטנה של אלה מתבדלים לגמטוציטים נשיים וזכריים. פלסמודיום פאלציפרום gametocytes הם ייחודיים בטבע כפי שהם לוקחים 7-10 ימים לפתח דרך חמישה שלבים שונים מבחינה מורפולוגית. גמטוציטים לא בוגרים משלב I ועד IV מופרדים בפרנצ’ימה של מח עצם ונשארים ברובם נעדרים מהמחזור ההיקפי2,3,4,5. אריתרוציטים נגועים ב gametocytes שלב בוגרים משתחררים במחזור הדם ומסתובבים בחופשיות כדי להילקח על ידי יתושים. ברגע שבתוך היתושים, הגמטוציטים מופעלים, באמצעות שינוי בטמפרטורה ובחשיפה לסביבת midgut, הופכים לגמטים נקביים וזכרים ומתחילים בפיתוח שלבי היתושים, אשר מגיע לשיאו עם השלבים ההדבקים של ספורוזויטים בבלוטות הרוק של היתושים6,7.
מאז טרייגרוג’נסון 8 תיאר שיטה סטנדרטית לתרבות P. falciparum, מחקרים על שלבי הדם הא-מיניים התקדמו מאוד. עם זאת, היעדר מערכת תרבות אמינה לשלבים מיניים הקשה על לימוד משחקי P. falciparum, ביולוגיה של שידור ושלבי יתושים. בשנים האחרונות פורסמו מספר שיטות אשר סייעו למעבדות בהקמת תרבויות gametocyte9,10,11,12. כתב יד זה מתאר פרוטוקול סטנדרטי ואמין לתרבות P. falciparum gametocytes שיכולים לייצג משאב בעל ערך לקהילת המחקר במלריה. שיטה זו מאפשרת ייצור חזק של gametocytes בוגר ומדבק אשר יחד עם פרוטוקול האכלת יתושים סטנדרטי, תוצאות זיהום יתושים אמין מאוד. שיטות אלה הוקמו כדי לשמור על אספקה רציפה של gametocytes, וטפילים בשלב יתושים. בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול תרבות gametocyte יסודי (איור 1),הכנת מאכילי קרום זכוכית וזיהום של יתושים באמצעות מאכילי ממברנות אלה (איור 2),ניתוח של midgut (איור 3) ובלוטת הרוק של יתושים (איור 4), וכימות זיהום יתושים לאחר אמצע וניתוח בלוטת הבריח.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות המתוארות כאן שימשו בהצלחה במכון לחקר המלריה של ג’ונס הופקינס במשך יותר מ -10 שנים15,16,17,18,19,20,21,22. Gametocytes המיוצר באמצעות פרוטוקול זה שימשו עב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לפילנתרופיה של בלומברג על התמיכה הכספית במכון ג’ונס הופקינס לחקר המלריה (JHMRI). עבודה זו לא הייתה מתאפשרת ללא המומחיות שמספקים מתקני הליבה של חרקים ופרזיטולוגיה של JHMRI.
Materials
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. World Health Organization. , (2018).
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E. Sexual Development of Malarial Parasites. Advances in Parasitology. 22, 153-216 (1983).
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B. Cultivation of malarial parasites. Nature. 273 (5664), 621-622 (1978).
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
