Plazmodium falciparum Yapay Membran Besleme Yoluyla Gametosit Kültürü ve Sivrisinek Enfeksiyonu
Summary
Sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamaları üzerinde ayrıntılı araştırmalar, etkili bulaşma engelleme stratejileri tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, enfeksiyöz gametositlerin etkili bir şekilde nasıl kültüreılacağını ve daha sonra bu gametositlerin sivrisineklere nasıl beslendiğini gösterir P. falciparumsivrisinek aşamaları .
Abstract
Sıtma, önemli morbidite ve mortaliteye neden olan en önemli halk sağlığı sorunlarından biri olmaya devam etmektedir. Sıtma, dişi Anopheles sivrisineklerinden bulaşıcı bir ısırık yoluyla bulaşan sivrisinek kaynaklı bir hastalıktır. Sıtma kontrolü sonunda sivrisineklere, sivrisineklere ve sivrisineklerden bulaşmayı engellemenin yollarını içeren çok sayıda yaklaşıma dayanacaktır. Laboratuvarda sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamalarını incelemek için, insan konakçıdan sivrisinek vektörüne bulaşmak için gerekli bir parazit aşaması olan son derece bulaşıcı Plasmodium falciparum gametositlerini kültüre etmek için bir protokol optimize ettik. P. falciparum gametositleri yaklaşık 1-2 hafta süren morfolojik olarak farklı beş adımla olgunlaşır. Bu protokolde açıklanan gametosit kültürü 15 günde tamamlanır ve 15-18. günlerden itibaren sivrisineklere bulaşıcıdır. Bu protokoller, sürekli bir enfeksiyon yetkin gametosit döngüsünü sürdürmek ve parazitin sivrisinek aşamalarının kesintisiz tedarikini sağlamak için geliştirilmiştir. Burada, gametosit kültürünün metodolojisini ve cam membran besleyiciler kullanarak sivrisineklerin bu parazitlerle nasıl enfekte olduğunu açıklıyoruz.
Introduction
Sıtma Plazmodium parazitlerinden kaynaklanır ve omurgalı konaklarına dişi Anopheles sivrisineklerinin bulaşıcı ısırması yoluyla bulaşır. Dünya Sağlık Örgütü’nün (WHO) 2019 raporuna göre, toplam 228 milyon sıtma vakasından tahmini 405.000 ölümoldu 1. Sıtmaya bağlı ölümlerin çoğu, özellikle beş yaşın altındaki çocuklar arasında Afrika bölgesinde yoğunlaşmıştır. Sıtmanın genel görülme oranı 2010 yılından itibaren küresel olarak azalırken, son yıllarda düşüş platolanmıştır ve hastalığı ortadan kaldırmak için acilen ek kontrol stratejilerine ihtiyaç vardır.
Sıtma parazitlerinin döngüsel aseksüel kan evreleri hastalık patogenezine neden olur ve bunların küçük bir alt kümesi kadın ve erkek gametositlerine ayrılır. Plazmodium falciparum gametositler, morfolojik olarak farklı beş aşamadan geçerek 7-10 gün sürdükleri için doğada benzersizdir. Aşama I’den IV’e olgunlaşmamış gametositler kemik iliği parankiminde inzdidadır ve büyük ölçüde periferik dolaşımda yoktur2,3,4,5. Olgun evre V gametositlerle enfekte olmuş eritrositler kan dolaşımında serbest bırakılır ve sivrisinekler tarafından alınmak üzere serbestçe dolaşır. Sivrisinek midgut içine girdikten sonra, gametositler, sıcaklıktaki bir değişiklik ve midgut ortamına maruz kalma yoluyla aktive edilir, dişi ve erkek gametlere dönüşür ve sivrisinek tükürük bezlerindeki sporozoitlerin enfektif aşamaları ile sonuçlanan sivrisinek aşamalarının geliştirilmesine başlar6,7.
Trager ve Jenson8 P. falciparumkültürü için standartlaştırılmış bir yöntem tanımladığından, aseksüel kan aşamaları üzerine çalışmalar büyük ölçüde ilerlemiştir. Bununla birlikte, cinsel aşamalar için güvenilir bir kültür sisteminin olmaması, P. falciparum gametositlerini, iletim biyolojisini ve sivrisinek aşamalarını incelemeyi zorlaştırmıştır. Son yıllarda, gametosit kültürlerinin kurulmasında laboratuvarlara yardımcı olan çeşitli yöntemler yayınlanmıştır9,10,11,12. Bu makale, sıtma araştırma topluluğu için değerli bir kaynağı temsil edebilecek P. falciparum gametositleri kültürü için standartlaştırılmış ve güvenilir protokolü açıklar. Bu yöntem, standartlaştırılmış bir sivrisinek besleme protokolü ile birlikte son derece güvenilir sivrisinek enfeksiyözitesi ile sonuçlanan olgun ve bulaşıcı gametositlerin sağlam üretimini sağlar. Bu yöntemler, gametositlerin ve sivrisinek evresi parazitlerinin kesintisiz tedarikini sağlamak için kurulmuştur. Bu yazıda, kapsamlı bir gametosit kültür protokolü (Şekil 1), cam membran besleyicilerin hazırlanması ve bu membran besleyiciler kullanılarak sivrisineklerin enfeksiyonu (Şekil 2), midgut diseksiyonu (Şekil 3) ve sivrisineklerin tükürük bezi (Şekil 4) ve midgut ve tükürük bezi diseksiyonu sonrası sivrisinekte enfeksiyonun nicelleştirilmesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntemler Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü’nde 10 yıldan fazla bir süredir başarıyla kullanılmaktadır15,16,17,18,19,20,21,22. Bu protokol kullanılarak üretilen gametositler, yüksek verimli gametositocidal tahliller<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü’ne (JHMRI) finansal destek için Bloomberg Hayırseverlerine teşekkür ediyor. JHMRI böcek ve parazitoloji çekirdek tesisleri tarafından sağlanan uzmanlık olmasaydı bu çalışma mümkün olmazdı.
Materials
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. World Health Organization. , (2018).
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E. Sexual Development of Malarial Parasites. Advances in Parasitology. 22, 153-216 (1983).
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B. Cultivation of malarial parasites. Nature. 273 (5664), 621-622 (1978).
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
