Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay
Summary
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Anweisungen zu geben, wie die Kapazität von Antikörpern gemessen werden kann, die in Seren oder Plasma von Individuen vorhanden sind, die natürlich einer Plasmodium falciparum-Infektion ausgesetzt sind, um die Phagozytose der parasiteninfizierten Erythrozyten (IEs) zu opsonisieren und zu induzieren.
Abstract
Das Protokoll beschreibt, wie ein Flusszytometrie-basierte Phagozytose-Assay von Plasmodium falciparum-infizierte Erythrozyten (IEs) von natürlich erworbenen IgG-Antikörpern speziell für VAR2CSA opsonisiert. VAR2CSA ist das Parasiten-Antigen, das die selektive Sequestrierung von IEs in der Plazenta vermittelt, die bei Schwangeren eine schwere Form von Malaria verursachen kann, die Plazenta-Malaria (PM). Der Schutz vor PM wird durch VAR2CSA-spezifische Antikörper vermittelt, von denen angenommen wird, dass sie funktionieren, indem sie die Plazentasese hemmen und/oder IEs für Phagozytose opsonisieren. Der Test verwendet spätstufensynchronisierte IEs, die in vitro ausgewählt wurden, um VAR2CSA, Plasma-/Serum-Antikörper von Frauen mit natürlich erworbener PM-spezifischer Immunität und die phagozytische Zelllinie THP-1 auszudrücken. Das Protokoll kann jedoch leicht geändert werden, um die Funktionalität von Antikörpern gegen jedes auf der IE-Oberfläche vorhandene Parasiten-Antigen zu überprüfen, unabhängig davon, ob es durch natürliche Exposition oder durch Impfung induziert wird. Der Assay bietet eine einfache und hochdurchsatzige Auswertung eines wichtigen funktionellen Aspekts der antikörpervermittelten Immunität bei Malaria mit guter Reproduzierbarkeit. Es ist daher nützlich bei der Bewertung der klinischen Immunität gegen P. falciparum Malaria, eine DerHauptursache von Morbidität und Mortalität in den Tropen, insbesondere in Afrika südlich der Sahara.
Introduction
Malaria ist eine vektorübertragene Krankheit, die beim Menschen bei einer Infektion mit fünf verschiedenen Arten der Gattung Plasmodiumverursacht wird. Die am weitesten verbreitete Art ist P. falciparum, die auch für die meisten Morbidität und Sterblichkeit verantwortlich ist1. Die klinische Darstellung von Malaria variiert von asymptomatischen oder gutartigen Infektionen bis hin zu komplizierten/schweren Erkrankungen, wobei letztere meist bei Kindern unter fünf Jahren auftritt. Die Exposition gegenüber P. falciparum induziert keine sterile Immunität, aber Personen, die in endemischen Gebieten leben, entwickeln langsam Immunität gegen die klinische Krankheit. Der Schutz ist alters-/expositionsabhängig und die Immunität wird normalerweise während der ersten 5-10 Lebensjahre erworben2. Erwachsene Frauen sind eine wichtige Ausnahme, da schwere Malaria während der Schwangerschaft in einer klinischen Präsentation auftreten kann, die als Plazenta-Malaria (PM) bekannt ist. PM ist eine wichtige Ursache für Abtreibung, Totgeburt, vorzeitige Geburt, niedriges Geburtsgewicht, fetalen Tod und mütterliche Anämie. Widerstand gegen PM entwickelt sich über aufeinander folgende Schwangerschaften3. Der Schutz vor PM ist mit dem Erwerb von Antikörpern gegen DEN VAR2CSA-Typ PfEMP14,5, ein infiziertes Erythrozyten(IE) Oberflächenantigen verbunden, das an Chondroitinsulfat A (CSA) bindet, das die IE-Sequestrierung in der Plazenta ermöglicht. Antikörper vermitteln Schutz durch verschiedene funktionelle Aktivitäten (überprüft in6,7), einschließlich der Opsonisierung von IEs, um Phagozytose zu induzieren. Frühe In-vitro-Studien zeigten, dass Antikörper das Wachstum von P. falciparum in Gegenwart von Monozyten über Phagozytose8,9begrenzen können. Neuere Studien haben gezeigt, dass höhere Konzentrationen von phagozytoseinduzierenden Antikörpern mit besseren Schwangerschaftsergebnissen (im Zusammenhang mit einer HIV-Koinfektion) verbunden sind10,11, was auf die Relevanz dieser Effektorfunktion in der natürlich erworbenen Immunantwort hinweist.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung dieser Funktion von Antikörpern im menschlichen Plasma/Serum vor, wobei in vitro kultivierte IEs VAR2CSA zusammen mit der Monozytenlinie THP-1 exezieren. Der Assay wurde zuvor11,12,13,,14,15,16,17,18 und gilt als ein verbesserter und einfacher Ansatz im Vergleich zu früheren mikroskopischen Protokollen8, da er das Testen einer größeren Anzahl von Antikörperproben in einem einzigen Durchlauf mit kleineren Mengen an Antikörpern ermöglicht und mühsame und voreingenommene Mikroskopiezählung vermeidet. Obwohl der Test von mehreren Laboratorien verwendet wurde und seine Ausführung einfach genug ist, erfordert er eine sorgfältige Planung und Vorbereitung, daher würde ein detailliertes Protokoll seine Anwendung durch Laboratorien und Forscher ohne vorherige Erfahrung ermöglichen. Wir verwenden als Beispiel spätstufensynchronisierte IEs, die VAR2CSA mit Antikörpern ausdrücken, die in Serum enthalten sind und von Frauen mit natürlich erworbener PM-spezifischer Immunität gesammelt wurden. Das Protokoll kann jedoch leicht geändert werden, um die Funktionalität von Antikörpern gegen jedes auf der IE-Oberfläche vorhandene Parasiten-Antigen zu überprüfen, unabhängig davon, ob es durch natürliche Exposition oder durch Impfung induziert wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll wurde zuvor beschrieben und12,15,17,31 verwendet, um die Kapazität von Antikörpern zu messen, die auf die Oberfläche von P. falciparum IEs abzielen, um Opsonisierung und Phagozytose durch THP-1-Zellen zu induzieren. Die hier vorgestellten Ergebnisse konzentrieren sich auf natürlich erworbene VAR2CSA-spezifische Antikörper im Plasma/Serum von Frauen,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maiken Visti wird für die hervorragende technische Unterstützung gedankt. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium (MAVARECA II; 17-02-KU) des dänischen Außenministeriums finanziert und vom Danida Fellowship Centre verwaltet. Der Geldgeber hatte keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
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