Summary

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

Published: August 06, 2020
doi:

Summary

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).

Abstract

El protocolo describe cómo configurar y ejecutar un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo de Plasmodium falciparum-infezocitos infectados (IEs) opsonizados por anticuerpos IgG adquiridos naturalmente específicos para VAR2CSA. Var2CSA es el antígeno parásito que media el secuestro selectivo de IEs en la placenta que puede causar una forma grave de malaria en mujeres embarazadas, llamada malaria placentaria (PM). La protección contra la PM está mediada por anticuerpos específicos de VAR2CSA que se cree que funcionan mediante la inhibición del secuestro de placenta y/o por opsonización de IEs para la fagocitosis. El ensayo emplea IEs sincronizadas en etapas tardías que han sido seleccionadas in vitro para expresar VAR2CSA, anticuerpos plasmáticos/suero de mujeres con inmunidad específica de PM adquirida naturalmente, y la línea de células fagocíticas THP-1. Sin embargo, el protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la funcionalidad de los anticuerpos contra cualquier antígeno parásito presente en la superficie de IE, ya sea inducido por la exposición natural o por la vacunación. El ensayo ofrece una evaluación sencilla y de alto rendimiento, con buena reproducibilidad, de un aspecto funcional importante de la inmunidad mediada por anticuerpos en el paludismo. Por lo tanto, es útil cuando se evalúa la inmunidad clínica al paludismo por P. falciparum, una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los trópicos, particularmente en el Africa subsahariana.

Introduction

La malaria es una enfermedad transmitida por vectores causada en humanos tras la infección con cinco especies diferentes del género Plasmodium. La especie más frecuente es P. falciparum,que también es responsable de la mayor morbilidad y mortalidad1. La presentación clínica del paludismo varía de infecciones asintomáticas o benignas a enfermedades complicadas/graves, esta última ocurre principalmente en niños menores de cinco años. La exposición a P. falciparum no induce inmunidad estéril, pero las personas que viven en zonas endémicas desarrollan lentamente inmunidad contra la enfermedad clínica. La protección depende de la edad/exposición y la inmunidad se adquiere normalmente durante los primeros 5-10 años de vida2. Las mujeres adultas son una excepción importante, ya que el paludismo grave puede ocurrir durante el embarazo en una presentación clínica conocida como malaria placentaria (PM). La PM es una causa importante de aborto, mortinato, parto prematuro, bajo peso al nacer, muerte fetal y anemia materna. La resistencia a la PM se desarrolla durante embarazos sucesivos3. La protección contra la PM se asocia con la adquisición de anticuerpos contra el sulfato de tipo VAR2CSA PfEMP14,5, un antígeno de superficie de eritrocitos infectados (IE) que se une al sulfato de condroitina A (CSA) que permite el secuestro de IE en la placenta. Los anticuerpos median la protección que realiza diversas actividades funcionales (revisadas en6,7) incluida la opsonización de las IE para inducir la fagocitosis. Los primeros estudios in vitro mostraron que los anticuerpos pueden limitar el crecimiento de P. falciparum en presencia de monocitos a través de la fagocitosis8,9. Estudios más recientes han demostrado que los niveles más altos de anticuerpos que inducen la fagocitosis se asocian con mejores resultados del embarazo (en el contexto de la coinfusión del VIH)10,11, lo que indica la relevancia de esta función efectora en la respuesta inmunitaria adquirida naturalmente.

Aquí presentamos un protocolo para medir esta función de los anticuerpos presentes en el plasma/suero humano, utilizando IE cultivado in vitro expresando VAR2CSA junto con la línea de monocitos THP-1. El ensayo se ha utilizado previamente11,12,13,14,15,16,17,18 y se considera un enfoque mejorado y más fácil en comparación con los protocolos basados en microscopio anterior8, ya que permite la prueba de un mayor número de muestras de anticuerpos en una sola ejecución utilizando volúmenes más pequeños de anticuerpos y evitando el recuento de microscopía tediosa y sesgada. A pesar de que el ensayo ha sido utilizado por múltiples laboratorios y su ejecución es lo suficientemente simple, requiere una planificación y preparación cuidadosas, por lo tanto, un protocolo detallado permitiría su aplicación por laboratorios e investigadores carentes de experiencia previa. Utilizamos, como ejemplo, las IE sincronizadas en etapas tardías que expresan VAR2CSA opsonizadas con anticuerpos presentes en suero recogidos de mujeres con inmunidad específica de PM adquirida naturalmente. Sin embargo, el protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la funcionalidad de los anticuerpos contra cualquier antígeno parásito presente en la superficie de IE, ya sea inducido por la exposición natural o por la vacunación.

Protocol

Las muestras de suero humano utilizadas para los resultados presentados aquí se recogieron en un estudio separado19. La colección fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del Instituto Memorial de Investigación Médica noguchi, Universidad de Ghana (estudio 038/10-11), y por los Comités Regionales de Etica de Investigación, Región Capital de Dinamarca (protocolo H-4-2013-083). 1. Cultivo de parásitos NOTA: Siga las regulacion…

Representative Results

Aquí presentamos en detalle un protocolo que previamente ha sido descrito31 y utilizado11,12,13,14,15,16,17,18 para medir la capacidad de los anticuerpos dirigidos a la superficie de P. falciparum IE para inducir opsonizaci…

Discussion

El protocolo presentado aquí ha sido descrito previamente y utilizado12,15,17,31 para medir la capacidad de los anticuerpos dirigidos a la superficie de P. falciparum IEs para inducir opsonización y fagocitosis por las células THP-1. Los resultados presentados aquí se centran en anticuerpos específicos de VAR2CSA adquiridos naturalmente en el plasma/suero de mujeres que viven en u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Maiken Visti es agradecido por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por una subvención (MAVARECA II; 17-02-KU) del Ministerio de Relaciones Exteriores de Dinamarca y administrado por el Centro de Becas Danida. El financiador no tenía ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

96 well cell culture plates, round bottom with lid Corning 3799 Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-II Gibco 11021-037
AlbuMAX-II (5%) 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibody Abcam ab34858 Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBS Sigma P8622
Dynabeads Protein G Invitrogen 10003D
Ethidium bromide solution Sigma E1510 Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometer Beckman Coulter Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099-141 Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16 BD Biosciences 555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32 BD Biosciences 552883
FITC mouse anti-human CD64 BD Biosciences 555527
FlowLogic software Inivai technologies Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL) Sigma G1272
Hypoxanthine Sigma H9377
L-glutamine (200mM) Sigma G7513
Lysing solution 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesories Miltenyi Biotec 130-041-305
Parasite culture medium 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) Sigma P0781
RPMI-1640 medium Sigma R5886
THP-1 culture medium 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnet Miltenyi Biotec

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Cite This Article
Quintana, M. d. P., Anabire, N. G., Hviid, L. Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay. J. Vis. Exp. (162), e61538, doi:10.3791/61538 (2020).

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