Ce protocole vise à transplanter un patch bioimprimé 3D sur l’épicardium de souris infarctus modélisant l’insuffisance cardiaque. Il comprend des détails concernant l’anesthésie, l’ouverture chirurgicale de coffre, la ligature permanente de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD) et l’application d’un patch bioimprimé sur la zone infarctus du coeur.
Tester les propriétés régénératrices des patchs cardiaques bioimprimés 3D in vivo à l’aide de modèles murins d’insuffisance cardiaque par l’intermédiaire de la ligature permanente de descente antérieure gauche (LAD) est une procédure difficile et a un taux de mortalité élevé en raison de sa nature. Nous avons développé une méthode pour transplanter constamment des plaques bioimprimées de cellules et d’hydrogels sur l’épicardium d’un cœur de souris infarctus pour tester leurs propriétés régénératrices d’une manière robuste et faisable. Tout d’abord, une souris profondément anesthésiée est soigneusement intubée et ventilée. Après la thoracotomie latérale gauche (ouverture chirurgicale de la poitrine), le LAD exposé est ligaté de façon permanente et le patch bioimprimé transplanté sur l’épicardium. La souris récupère rapidement de la procédure après la fermeture de la poitrine. Les avantages de cette approche robuste et rapide comprennent un taux de mortalité prévu à 28 jours allant jusqu’à 30 % (inférieur aux 44 % rapportés par d’autres études utilisant un modèle similaire de ligature permanente de LAD chez les souris). En outre, l’approche décrite dans ce protocole est polyvalente et pourrait être adaptée pour tester les patchs bioimprimés à l’aide de différents types de cellules ou d’hydrogels où un grand nombre d’animaux sont nécessaires pour alimenter de façon optimale les études. Dans l’ensemble, nous présentons cela comme une approche avantageuse qui peut changer les tests précliniques dans les études futures pour le domaine de la régénération cardiaque et de l’ingénierie tissulaire.
Une transplantation cardiaque est le traitement de référence pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque en phase finale, mais il ya une pénurie d’organes donneurs. Il nécessite la suppression du système immunitaire pour prévenir le rejet de greffe et le taux de mortalité d’un an est de 15% dans le monde1. Par conséquent, il existe une incitation de longue date à régénérer le myocarde dans les modèles animaux précliniques en vue de traduire en essais humains2,3,4,5,6,7,8,9. Les progrès récents dans la bioimpression 3D des cellules souches ou des cellules cardiaques dérivées de cellules souches ont attiré l’attention comme une approche prometteuse pour régénérer le myocarde2,3,9,10,11,12.
Les premiers essais d’innocuité humaine appliquant des patchs pour régénérer le cœur ont été rapportés, avec des cellules mononucléaires autologues de moelle osseuse suspendues dans le collagène ou les cellules progénitrices cardiaques dérivées de cellules souches embryonnaires en fibrine, transplantées à l’épicarde7,8,13. Cependant, pour une méthode plus précise, évolutive, automatisable et reproductible, la bioimpression 3D des patchs hydrogel optimisés à appliquer à la surface épicardiale du cœur est une approche prometteuse pour régénérer le myocarde pour les patients qui auraient autrement besoin d’une transplantation cardiaque2,10,11,12.
Avant que la traduction aux essais humains puisse se produire, des études précliniques sur les animaux sont nécessaires. Des modèles in vivo précliniques poursuivant la régénération du myocarde ont été rapportés chez les porcs5, les moutons14, les rats6 et les souris4. Un modèle commun d’infarctus du myocarde (MI) chez les souris utilise la ligature permanente de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD)15,16. Parmi les différentes souches de souris utilisées, la ligature permanente de LAD chez les souris C57BL6 a un taux de survie acceptable et présente généralement le remodelage cohérent et les changements cardiaques après MI16. Dans les modèles de rongeurs, plusieurs approches ont été décrites où le tissu cardiaque a été appliqué au cœur à la poursuite de la régénération efficace du myocarde endommagé4,6,17. Alors que les grands animaux représentent encore un modèle plus cliniquement pertinent pour tester les propriétés régénératrices cardiaques5,14, la polyvalence et la faisabilité du modèle de souris se prête à cette zone d’étude en mouvement rapide. Cela peut éviter certains des pièges typiques des études sur les grands animaux, y compris (mais sans s’y limiter) : 1) la mortalité animale élevée (à moins que les artères coronaires diagonales ne soient ligatées conduisant à des infarctus segmentaux imprévisibles14, ou l’extrémité distale du LAD est occlus suivie d’une reperfusion au lieu d’une ligature permanente5); 2) les questions éthiques liées aux dommages relativement accrus causés par les protocoles sur les gros animaux par rapport aux souris18; 3) l’augmentation des coûts et/ou des problèmes de faisabilité, par exemple l’indisponibilité relative des grands équipements pour animaux tels que les scanners IRM14. Il est également important de considérer que, compte tenu de la longue durée et de l’engagement typiques des études sur les grands animaux, ils ont le potentiel de devenir obsolètes avant d’être terminés, en particulier avec les développements rapides typiques de ce domaine. Par exemple, ce n’est que récemment que le rôle critique joué par les cellules inflammatoires et les médiateurs dans la régulation de la régénération cardiaque a émergé19,20. En outre, le rôle critique des études précliniques, tels que les modèles de petits animaux, a été mis en évidence par une Commission Lancet comme une étape essentielle pour acquérir des connaissances solides avant de passer à des essais humains21.
Pour faciliter les progrès dans la compréhension des mécanismes et l’optimisation des conditions pour les approches de régénération cardiaque à base de patchs in vivo, nous présentons une nouvelle approche décrivant une méthode de « scoop et drapé » pour appliquer un patch hydrogel d’alginate/gélatine 3D bioimprimé à la surface des coeurs infrcted chez les souris C57BL6. L’objectif de cette approche est de fournir un modèle in vivo polyvalent pour tester des patchs bioimprimés 3D qui sont susceptibles d’être réalisables dans de vastes contextes de recherche pour le domaine en évolution rapide de la régénération cardiaque2. Cette méthode pourrait être adaptée aux patchs d’essai générés par des méthodes non bioimprimantes, différentes hydrogels et cellules autologues ou allogéniques dérivées des cellules souches dans les patchs in vivo. Cependant, l’examen détaillé de la bioimpression, des hydrogels ou des types de cellules est au-delà de la portée de cette étude qui se concentre sur la méthode de transplantation chirurgicale.
Les avantages du protocole incluent que l’infarctus du myocarde et l’application d’un patch bioimprimé sont effectués dans une intervention chirurgicale qui peut être effectuée rapidement, avec facilement disponibles, des outils de laboratoire rentables et avec un taux de mortalité relativement faible. Il permet également généralement un nombre plus élevé d’animaux que les grands modèles animaux dans un espace plus petit, ce qui permet une comparaison robuste de plusieurs groupes expérimentaux, particulièrement utile pour la comparaison de groupe multiple in vivo. D’autre part, ce protocole présente les inconvénients que: 1) le modèle de souris est plus éloigné de la taille du cœur humain, l’anatomie et la physiologie que dans les grands modèles animaux et il ne se traduit pas directement chez l’homme; 2) les branches murines lad proximally, avec une variabilité significative entre les souris individuelles, ce qui conduit à la variabilité de la taille des infarctus (un problème partagé avec les grands modèles animaux); 3) le patch doit être appliqué sur toute la surface du cœur antérieur, ce qui est moins précis que l’application sur une zone infarctus spécifique; et 4) le patch est appliqué immédiatement au moment de l’IM (pour usage humain, il est susceptible d’être plus cliniquement utile pour développer un patch pour l’application à l’insuffisance chronique des mois cardiaques après le MIinitial 14).
Néanmoins, s’il est choisi de manière appropriée selon l’hypothèse testée, ce protocole peut fournir rapidement des données in vivo critiques, avec des n nombres élevés, d’une manière qui soit compatible avec les matériaux, le budget et l’expertise disponibles dans la plupart des laboratoires. Par rapport aux grands modèles animaux, il s’agit d’un modèle in vivo suffisamment polyvalent pour s’adapter aux nouvelles technologies de bioimpression 3D (par exemple, par la relative facilité d’effectuer des études pilotes pour tester la faisabilité et la sécurité avant de passer à de plus grands modèles animaux). Il serait bien adapté pour les chercheurs qui veulent générer des données in vivo efficacement et à moindre coût, peut-être en exécutant de multiples comparaisons de patchs bioimprimés 3D avec différents paramètres de bioimpression, des cellules ou des hydrogels dans les correctifs. Il serait particulièrement utile pour tester les interactions de différents mélanges de cellules souches et de cellules dérivées de cellules souches avec des hydrogels in vivo sans gaspillage excessif de lignées cellulaires coûteuses ou d’autres matériaux qui pourraient se produire si vous utilisez des patchs à grande échelle. L’utilisation d’un modèle de souris faciliterait également l’essai de plaques contenant des lignées de cellules et de cellules souches dérivées de souris compatibles avec les espèces ou des cellules d’origine humaine où des souris uniformes présentant une déficience immunitaire spécifique sont souhaitables. En outre, des tests sur des souches de souris génétiquement modifiées pourraient permettre aux chercheurs d’isoler les effets de gènes spécifiques sur les voies de signalisation et dans des types de cellules spécifiques pertinents aux maladies cardiovasculaires, ce qui ne serait pas possible actuellement dans un grand modèle animal.
La méthode permet à l’opérateur de transplanter efficacement un patch bioimprimé en l’appliquant à la surface épicardiale d’un cœur de souris infarctus suivant la ligature permanente de LAD. Dans cette méthode axée sur la faisabilité, nous sommes en mesure d’effectuer cette procédure sur huit souris par jour ouvrable (y compris la préparation de la salle avant et après). Une bioimpression produisant huit patchs de 1 cm2 dans des puits de plaques de six puits prend de 2 à 3 heures (y compris le temps de préparation avant et après). Nous avons utilisé l’intérieur stérile d’un paquet de scalpel chirurgical comme scoop pour notre patch, qui est facilement accessible et ajoute généralement un coût minimal, en utilisant les propriétés adhésives naturelles de l’alginate / patch hydrogel gélatine pour draper le patch à travers la surface antérieure infarctus du cœur. D’après notre expérience, le protocole de ligature LAD chez les souris est dépendant de l’opérateur et un taux de mortalité plus faible à 28 jours peut être atteint avec des opérateurs expérimentés spécialisés dans un seul modèle. Van den Borne et coll.16 ont rapporté que les souris C57BL6 présentent une mortalité de 44% après une ligature permanente de LAD à 28 jours sans l’application d’un patch, qui est plus élevé que la limite supérieure de 30% que nous avons observée avec la méthode.
L’étape d’intubation est critique et en soi peut être une source de mortalité pour les souris à moins d’être effectuée par un opérateur qualifié. Il est rendu difficile en raison de la petite taille de la trachée, c’est pourquoi les loupes sont portées par l’opérateur pour cette étape. Nous utilisons de la kétamine/xylazine injectée ainsi que de l’isofluorane inhalé pour l’induction de l’anesthésique afin que la souris soit profondément anesthésiée à des doses relativement faibles de chaque médicament. Par conséquent, il n’y a aucun risque pour la souris de se réveiller au cours de cette étape d’intubation, mais la mortalité élevée associée à des doses élevées d’un seul médicament est évitée. L’atropine a également été donnée pour contrecarrer des effets secondaires tels que la bradycardie et l’hypersalivation. L’utilisation d’un projecteur appliqué sur la gorge illumine la trachée à l’intérieur de sorte qu’elle est plus visible et les cordes vocales doivent être visualisées s’ouvrant et se refermant avec la fréquence respiratoire de la souris (habituellement ~120 respirations par minute). Il est essentiel de positionner la souris parfaitement (c’est pourquoi une surface dure est préférée plutôt qu’un tapis chauffant sous la souris pour cette étape) avec les deux dents incisives tenues par un fil en boucle et la langue rétractée extrêmement doucement avec des forceps émoussés / paire de spatules pour ouvrir la bouche et visualiser la trachée. Une fois l’intubation terminée, l’opérateur doit faire attention de ne pas déloger le tube dans le transfert de la zone d’intubation au lit de fonctionnement (qui a un tapis de chaleur en dessous pour prévenir l’hypothermie). Lors du raccordement du tube respiratoire à l’appareil de ventilation, il est essentiel de stabiliser le tube d’une main et de connecter le circuit du ventilateur avec l’autre, de sorte qu’il y ait un mouvement minimal du tube respiratoire comme le pousser plus profondément dans la trachée lors de la connexion du segment de ventilation du tube.
Dans cette étude, nous avons utilisé l’alginate 4% (w/v)/gélatine 8% (w/v) dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Les hydrogels alginate/gélatine sont connus pour leurs propriétés biocompatibilité, low cost et biomécaniques, ce qui les rend utiles pour les stratégies d’ingénierie tissulaire 3D23. Ces hydrogels peuvent être croisés par une légère gélation en ajoutant des ions de calcium, ce qui permet de modifier la viscosité. Après la bioimpression, nous avons appliqué du chlorure de calcium (CaCl2) 2 % (w/v) dans la solution saline tamponnée par phosphate (PBS) sur des patchs, puis nous les avons cultivés en DMEM dans six plaques de puits pendant 7 à 14 jours avant de les transplanter. C’était la fenêtre optimale après que des corrections contenant des cellules cardiaques aient commencé à battre dans la culture mais avant que les corrections aient commencé à se désintégrer. Alors que CaCl2 pouvait être ajouté régulièrement tout au long de la phase de post-bioimpression pour réduire la désintégration du patch, nous avons constaté que la viscosité intrinsèque de l’hydrogel était suffisante pour les patchs de maintenir leur structure jusqu’à la transplantation avec une seule dose initiale de CaCl2.
La méthode a permis une transplantation réussie sans sutures (ce qui peut endommager le cœur) ou de la colle (qui peut bloquer l’interface entre le patch et le cœur). Les études futures peuvent confirmer l’hypothèse que la transplantation sans suture et sans colle n’a pas d’impact négatif sur l’engrafment chez les souris car il est essentiel que le patch ne glisse pas du cœur ou interférer avec les poumons. D’autres études évaluant l’engreffement des plaques dans les modèles permanents de ligature LAD avec la réparation à base depatchs 3 ont mesuré la zone engraftée (mm2) restant avec le temps24, l’épaisseur greffée de patch (μm) reminage avec le temps25, quantification des cellules transplantées par réaction en chaîne de polymérase (PCR)26 ou flux d’émission de photons de bioluminescence des cellules de donneur vivants étiquetées (une mesure des photons émis par seconde qui peuvent quantifier les cellules greffées étiquetées qui survivent chez les animaux vivants au fil du temps)27. Les études futures peuvent utiliser ces méthodes pour évaluer plus avant si la transplantation sans suture et sans colle affecte l’engraftment de patch (aussi bien que les effets structurels et fonctionnels sur le myocarde d’hôte). Néanmoins, macroscopiquement après 28 jours in vivo dans nos souris immunocompétentes, le mediastinum antérieur a présenté le matériel fibrinous variable et les adhérences. Le mécanisme de régénération cardiaque à base de patch peut être de la stimulation des réponses inflammatoires de macrophage d’hôte19 ou des facteurs immunologiques sécrétés20 plutôt que le réapprovisionnement numérique de cellules. Si l’inflammation joue un rôle positif, la présence de matériel hydrogel étranger peut être bénéfique. Alternativement, pour réduire la présence de matériel étranger, il peut être bénéfique si la composante hydrogel se désintègre au fil du temps. En fait, certaines approches utilisent des biomatériaux qui soutiennent les cellules d’abord, puis se désintègrent, ne laissant que des tissus28,29. Les études futures visant à analyser complètement l’engraftment des patchs et à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la régénération cardiaque basée sur les patchs peuvent mener à des conceptions expérimentales optimisées avant la traduction aux essais humains2.
Dans l’ensemble, ce protocole est susceptible d’être largement réalisable et également adapté à la mise à l’essai de plusieurs groupes de patchs bioimprimés 3D, par exemple avec différents contenus cellulaires. Les orientations futures de cette méthode comprennent la bioimpression de plaques contenant des hydrogels avancés qui n’ont pas été testés auparavant in vivo ou l’essai des effets de différentes cellules autologues ou allogéniques dérivées des cellules souches, pour l’optimisation avant de passer à de grands modèles animaux.
The authors have nothing to disclose.
Merci à Natalie Johnston pour l’enregistrement des séquences non chirurgicales et tout le montage vidéo.
3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
Atropine suplhate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals – 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |