פרוטוקול זה נועד להשתיל תיקון ביו-מודפס בתלת-ממד על האפיקארדיום של עכברים אוטמים המדגמים אי ספיקת לב. הוא כולל פרטים לגבי הרדמה, פתיחת החזה הכירורגית, קשירה קבועה של העורק הקדמי השמאלי (LAD) העורק הכלילי ויישום של תיקון bioprinted על האזור האוטם של הלב.
בדיקת תכונות רגנרטיביות של 3D bioprinted מדבקות לב vivo באמצעות מודלים מורין של אי ספיקת לב באמצעות קבוע שמאל קדמי יורד (LAD) קשירה הוא הליך מאתגר ויש לו שיעור תמותה גבוה בשל אופיו. פיתחנו שיטה להשתלת באופן עקבי טלאים מודפסים ביולוגית של תאים והידרוג’לים על האפיקארדיום של לב עכבר אוטם כדי לבדוק את תכונותיהם המתחדשות בצורה חזקה ו אפשרית. ראשית, עכבר מנוקב עמוק הוא צנרר בקפידה ומאוורר. בעקבות ניקור חזה לרוחב שמאל (פתיחה כירורגית של החזה), LAD החשוף הוא קשירה לצמיתות ואת התיקון bioprinted מושתל על האפיקארדיום. העכבר מתאושש במהירות מההליך לאחר סגירת החזה. היתרונות של גישה חזקה ומהירה זו כוללים שיעור תמותה צפוי של 28 יום של עד 30% (נמוך יותר מאשר 44% שדווחו על ידי מחקרים אחרים באמצעות מודל דומה של קשירה LAD קבוע בעכברים). יתר על כן, הגישה המתוארת בפרוטוקול זה היא רב-תכליתית וניתן להתאים אותה לבדיקה של תיקונים מודפסים ביולוגית באמצעות סוגי תאים שונים או הידרוג’לים שונים שבהם יש צורך במספרים גבוהים של בעלי חיים כדי להשתמש במחקרי כוח אופטימליים. בסך הכל, אנו מציגים זאת כגישה יתרון אשר עשוי לשנות בדיקות פרה-קליניות במחקרים עתידיים עבור תחום התחדשות הלב והנדסת רקמות.
השתלת לב היא טיפול סטנדרטי זהב עבור חולים עם אי ספיקת לב בשלב הסופי אבל יש מחסור של איברי תורם. זה דורש דיכוי מערכת החיסון כדי למנוע דחיית שתלים, שיעור התמותה לשנה אחת הוא 15% ברחבי העולם1. לכן, יש תמריץ ארוך שנים כדי לחדש את שריר הלב במודלים בעלי חיים פרה-קליניים עם נוףלתרגום לניסויים בבני אדם 2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. ההתפתחויות האחרונות בהדפסה ביולוגית תלת-מית של תאי גזע או תאי לב שמקורם בתאי גזע זכו לתשומת לב כגישה מבטיחה לחידוש שריר הלב2,,3,,9,,10,,11,,12.
ניסויי בטיחות האדם הראשונים החלת טלאים כדי לחדש את הלב דווחו, עם תאי מוח עצם אוטולוגיים mononuclear תלוי קולגן או תאי גזע עוברי נגזר תאי מבשר לב בפיברין, מושתלים epicardium7,8,13. עם זאת, עבור שיטה מדויקת יותר, מדרגית, automatable ושחזור, bioprinting 3D של מדבקות הידרוג’ל אופטימיזציה להיות מיושם על פני השטח epicardial של הלב היא גישה מבטיחה כדי לחדש את שריר הלב עבור חולים שאחרתהיו צריכים השתלת לב 2,,10,,11,,12.
לפני תרגום לניסויים בבני אדם יכול להתרחש, מחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים נדרשים. Preclinical במודלים vivo רודף התחדשות של שריר הלב דווח חזירים5,כבשים 14,חולדות 6 ועכברים 4. מודל נפוץ של אוטם שריר הלב (MI) בעכברים משתמש קשירה קבועה של העורק הקדמי השמאלי יורד (LAD)עורק כלילי 15,,16. בין הזנים השונים של עכברים בשימוש, קשירה LAD קבוע בעכברים C57BL6 יש שיעור הישרדות מקובל בדרך כלל מציג שיפוץ עקבי ושינויים לב לאחר MI16. במודלים מכרסמים, מספר גישות תוארו שבו רקמת הלב הוחלה על הלב במרדף אחר התחדשות יעילה של שריר הלב פגום4,,6,,17. בעוד בעלי חיים גדולים עדיין מייצגים מודל רלוונטי יותר מבחינה קלינית כדי לבדוקתכונות התחדשותהלב 5,14, הרב-תכליתיות והכדאיות של מודל העכבר משאיל את עצמו לאזור זה של מחקר נע במהירות. זה עשוי למנוע חלק מהמלכודות האופייניות של מחקרים גדולים בבעלי חיים, כולל (אך לא רק): 1) תמותה גבוהה של בעלי חיים (אלא אם כן עורקים כליליים אלכסוניים קשורים המובילאוטם מגזרי בלתי צפוי 14, או הסוף הדיסטלי של LAD הוא חסום ואחריו reperfusion במקוםקשירה קבועה 5); 2) בעיות אתיות עם הפגיעה המוגברת יחסית שנגרמה על ידי פרוטוקולים בעלי חיים גדולים בהשוואה לעכברים18; 3) בעיות עלות ו/או היתכנות מוגברות, למשל חוסר זמינות יחסית של ציוד בעל חיים גדול כגון סורקי MRI14. חשוב גם לקחת בחשבון כי בהתחשב משך הזמן הנרחב ומחויבות אופייני של מחקרים גדולים בבעלי חיים, יש להם את הפוטנציאל להיות מיושן לפני שהם סיימו, במיוחד עם ההתפתחויות המהירות האופייניות של תחום זה. לדוגמה, רק לאחרונה התגלה כי התפקיד הקריטי שממיאים תאים דלקתיים ומתווכים בוויסות התחדשות הלבעלה 19,20. יתר על כן, התפקיד הקריטי של מחקרים פרה-קליניים, כגון מודלים בעלי חיים קטנים, הובלט על ידי ועדת Lancet כצעד חיוני כדי להשיג ידע חזק לפני המעבר לניסוייםבבני אדם 21.
כדי להקל על ההתקדמות בהבנת מנגנונים ואופטימיזציה תנאים עבור גישות התחדשות לב מבוססתיקון ב vivo, אנו מציגים גישה חדשנית המתארת שיטה ‘סקופ ו- וילונות’ כדי להחיל תיקון הידרוג’ל אלגנאט/ג’לטין 3D מודפס על פני השטח של לבבות אוטמים בעכברים C57BL6. מטרת גישה זו היא לספק רב-תכליתי במודל vivo כדי לבדוק תיקונים ביו-מודפסים בתלת-ממד שסביר להניח שיהיו אפשריים בהקשרי מחקר רחבים עבור התחום המתפתח במהירות של התחדשותהלב 2. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לבדיקה תיקונים שנוצרו על ידי שיטות שאינן bioprinting, הידרוג’לים שונים ותאים אוטולוגיים או אלוגניים נגזר תאי גזע בתוך תיקונים vivo. עם זאת, שיקול מפורט של bioprinting, הידרוג’לים או סוגי תאים הוא מעבר להיקף של מחקר זה המתמקד בשיטת השתלה כירורגית.
היתרונות של הפרוטוקול כוללים כי אוטם שריר הלב ויישום של תיקון bioprinted מבוצעים בהליך כירורגי אחד שניתן לבצע במהירות, עם זמין, כלי מעבדה חסכוניים ועם שיעור תמותה נמוך יחסית. הוא גם מאפשר בדרך כלל מספר גבוה יותר של בעלי חיים מאשר מודלים בעלי חיים גדולים בחלל קטן יותר, המאפשר השוואה חזקה של קבוצות ניסיוניות מרובות, שימושי במיוחד עבור השוואה קבוצתית מרובה vivo. מצד שני, פרוטוקול זה יש את החסרונות כי: 1) מודל העכבר הוא רחוק יותר מגודל הלב האנושי, אנטומיה ופיזיולוגיה מאשר במודלים בעלי חיים גדולים וזה לא ישירות לתרגם לבני אדם; 2) הענפים murine LAD proximally, עם שונות משמעותית בין עכברים בודדים, מה שמוביל השתנות גודל אוטם (בעיה משותפת עם מודלים בעלי חיים גדולים); 3) יש להחיל את התיקון על כל משטח הלב הקדמי, שהוא פחות מדויק מאשר החלת על אזור אוטם מסוים; ו 4) התיקון מוחל מיד בזמן MI (לשימוש בבני אדם זה עשוי להיות שימושי יותר קלינית לפתח תיקון עבור יישום לב כושל אוטם כרוני חודשים לאחר MIהראשוני 14).
עם זאת, אם נבחר כראוי על פי ההשערה שנבדקו, פרוטוקול זה יכול לספק קריטי בנתוני vivo במהירות, עם מספרי n גבוהים, באופן העולה בקנה אחד עם החומרים, התקציב והמומחיות הזמינים ברוב המעבדות. בהשוואה למודלים בעלי חיים גדולים, זהו מודל vivo שהוא רב-תכליתי מספיק כדי להסתגל לטכנולוגיות ביו-הדפסה תלת-מית-מיו-מיו-מית-יותיות (לדוגמה, על ידי הקלות היחסית בביצוע מחקרי פיילוט כדי לבדוק היתכנות ובטיחות לפני המעבר למודלים בעלי חיים גדולים יותר). זה יהיה מתאים היטב עבור חוקרים שרוצים ליצור בנתוני vivo ביעילות ובצול, אולי הפעלת השוואות מרובות של תיקונים bioprinted 3D עם פרמטרים bioprinting שונים, תאים או הידרוג’לים במדבקות. זה יהיה שימושי במיוחד לבדיקת האינטראקציות של תערובות שונות של תאי גזע ותאים נגזרים תאי גזע עם הידרוג’לים ב vivo ללא בזבוז עודף של תלאות תאים יקרים או חומרים אחרים שעלולים להתרחש אם באמצעות תיקונים בקנה מידה גדול. שימוש במודל עכבר גם להקל על בדיקות של תיקונים המכילים תאים תואמי מין העכבר וגזע תוחונים או תאים נגזרים על ידי בני אדם שבו עכברים אחידים עם מחסור חיסוני ספציפי רצויים. בנוסף, בדיקות בזני עכבר מהונדסים גנטית יכול לאפשר לחוקרים לבודד את ההשפעות של גנים ספציפיים על מסלולי איתות וסוגי תאים ספציפיים הרלוונטיים למחלות לב וכלי דם, אשר לא יהיה אפשרי כיום במודל בעלי חיים גדול.
השיטה מאפשרת למפעיל להשתיל ביעילות תיקון מודפס ביולוגית על ידי החלתו על פני השטח האפירדיאליים של לב עכבר אוטם בעקבות קשירה קבועה של LAD. בשיטה זו ממוקדת היתכנות, אנו מסוגלים לבצע הליך זה על שמונה עכברים ליום עבודה (כולל הכנת החדר לפני ואחרי). הריצה של bioprinting המייצרת שמונה 1ס”מ 2 טלאים בארות של לוחות שש בארות לוקח 2-3 שעות (כולל זמן הכנה לפני ואחרי). השתמשנו בסטרילי בתוך חבילת אזמל כירורגי כסקופ עבור התיקון שלנו, אשר נגיש בדרך כלל מוסיף עלות מינימלית, ניצול המאפיינים הדביקים הטבעיים של מדבקת הידרוג’ל אלגנטי/ג’לטין כדי לעטוף את המדבקה על פני פני השטח הקדמי אוטם של הלב. מניסיוני, הפרוטוקול עבור קשירה LAD בעכברים הוא תלוי מפעיל שיעור תמותה נמוך יותר ב 28 ימים ניתן להשיג עם מפעילים מנוסים המתמחים במודל אחד. ואןדן בורן ואח ’16 דיווח כי עכברים C57BL6 להציג 44% תמותה בעקבות קשירה LAD קבוע ב 28 ימים ללא יישום של תיקון, שהוא גבוה יותר מאשר הגבול העליון של 30% שראינו עם השיטה.
שלב צנרור הוא קריטי ובאופן בפני עצמו יכול להיות מקור תמותה לעכברים אלא אם כן בוצע על ידי מפעיל מיומן. זה נעשה קשה בשל הגודל הזעיר של קנה הנשימה, ולכן זכוכית מגדלת משוחקים על ידי המפעיל עבור שלב זה. אנו משתמשים קטמין מוזרק / xylazine, כמו גם שואף isofluorane אינדוקציה של הרדמה, כך העכבר הוא הרדמה עמוקה במינונים נמוכים יחסית של כל תרופה. לכן, אין סיכון לעכבר להתעורר במהלך שלב צנרור זה, אבל התמותה הגבוהה הקשורים במינונים גבוהים של תרופה אחת נמנעת. אטרופין ניתנה גם כדי לנטרל תופעות לוואי כגון ברדיקרדיה ו hypersalivation. השימוש באור הזרקורים המיושם על הגרון מדליק חיצוני את קנה הנשימה באופן פנימי, כך שהוא גלוי יותר ויש לדמיין את מיתרי הקול נפתחים וסוגרים עם קצב הנשימה של העכבר (בדרך כלל כ-120 נשימות לדקה). זה קריטי למקם את העכבר בצורה מושלמת (ולכן משטח קשה מועדף ולא מחצלת חימום מתחת לעכבר לצעד זה) עם שתי שיניים שן השיניים השיניים השיניים המחזיקות על ידי חוט לולאה והלשון נסוגה בעדינות רבה עם מלקות קהות / זוג מריות כדי לפתוח את הפה ולדמיין את קנה הנשימה. לאחר השלמת השרירור, על המפעיל להיזהר שלא לנתק את הצינור בהעברה מאיזור צנרור למיטת ההפעלה (שיש לה מחצלת חום מתחתיה כדי למנוע היפותרמיה). בעת חיבור צינור הנשימה למערכת ההנשמה, חשוב לייצב את הצינור ביד אחת ולחבר את מעגל ההנשמה עם השני, כך שיש תנועה מינימלית של צינור הנשימה כגון דחיפתו עמוק יותר לתוך קנה הנשימה בעת חיבור קטע מכונת ההנשמה של הצינורות.
במחקר זה, השתמשנו אלגנטי 4% (w / v)/ ג’לטין 8% (w / v) במדיום נשר שונה של Dulbecco (DMEM). אלגנאט/ ג’לטין הידרוג’לים ידועים שלהם biocompatibility, עלות נמוכה ומאפיינים ביומכניים מה שהופך אותם שימושי עבור אסטרטגיות הנדסת רקמות3D 23. הידרוג’לים אלה יכולים להיות מוצלבים על ידי gelation מתון על ידי הוספת יוני סידן, המאפשר צמיגות להשתנות. לאחר bioprinting, יישם סידן כלורי (CaCl2)2% (w / v) בתמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) על טלאים ולאחר מכן תרבות אותם DMEM בשש צלחות באר במשך 7-14 ימים לפני השתלתם. זה היה החלון האופטימלי לאחר טלאים המכילים תאי לב החלו להכות בתרבות אבל לפני טלאים החלו להתפורר. בעוד CaCl2 ניתן להוסיף באופן קבוע לאורך כל שלב שלאחר bioprinting כדי להפחית את התפוררות תיקון, מצאנו כי צמיגות פנימית של הידרוג’ל היה מספיק עבור תיקונים כדי לשמור על המבנה שלהם עד השתלה עם רק מנה ראשונית אחת של CaCl2.
השיטה אפשרה השתלה מוצלחת ללא תפרים (אשר עלול לפגוע בלב) או דבק (אשר עשוי לחסום את הממשק בין התיקון ללב). מחקרים עתידיים עשויים לאשר את ההשערה כי השתלה ללא דבק ותפר אינה משפיעה לרעה על ההשתלה בעכברים כפי שהוא קריטי כי התיקון לא להחליק מהלב או להפריע לריאות. מחקרים אחרים המעריכים את ההתרה של טלאים במודלים קבועים של קשירה LAD עםתיקון מבוסס תיקון 3 מדדו שטח חחירה (מ”מ2)שנותרעם זמן 24, עובי תיקון מושתל (μm) כרייהעם זמן 25,כימות של השתלה תאים מתובלים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR)26 או שטף פליטת פוטון bioluminescence של תאים תורמים חיים מסומנים (מידה של פוטונים הנפלטים לשנייה אשר יכול לכמת תאים מתובלים ששרדו בבעלי חיים חיים לאורך זמן)27. מחקרים עתידיים עשויים להשתמש בשיטות אלה כדי להעריך עוד יותר אם השתלה ללא תפרים וחסרי דבק משפיעה על חפירת התיקון (כמו גם השפעות מבניות ופונקציונליות על שריר הלב המארח). עם זאת, באופן מאקרוסקופי לאחר 28 ימים בvivio בעכברים immunocompetent שלנו, mediastinum הקדמי הציג חומר פיברינוס משתנה הידבקויות. המנגנון של התחדשות לב מבוססת תיקון עשוי להיות מגירוי של תגובות דלקתיות מקרופאגהמארח 19 או גורמים חיסונייםהפרשת 20 ולא חידוש תאים מספריים. אם דלקת ממלאת תפקיד חיובי, הנוכחות של חומר הידרוג’ל זר עשוי להיות מועיל. לחלופין, כדי להפחית את הנוכחות של חומר זר זה עשוי להיות מועיל אם רכיב הידרוג’ל מתפורר לאורך זמן. למעשה, גישות מסוימות להשתמש בחומרים ביולוגיים התומכים בתאים בתחילה ולאחר מכן להתפורר, עוזב רקרקמה 28,29. מחקרים עתידיים כדי לנתח באופן מלא תיקון engraftment ולהבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי התחדשות לב מבוססת תיקון עשוי להוביל עיצובים ניסיוניים אופטימיזציה לפניתרגום לניסויים בבני אדם 2.
בסך הכל, פרוטוקול זה עשוי להיות אפשרי באופן נרחב ומתאים גם לבדיקת קבוצות מרובות של תיקונים מודפסים ביולוגית בתלת-ממד, למשל עם תוכן סלולרי שונה. כיוונים עתידיים לשיטה זו כוללים את הביוהדינטציה של תיקונים המכילים הידרוג’לים מתקדמים שלא נבדקו בעבר ב-vivo או בדיקת ההשפעות של תאים שונים של תאי גזע אוטולוגיים או אלוגניים, לצורך אופטימיזציה לפני שתמשיך למודלים בעלי חיים גדולים.
The authors have nothing to disclose.
עם תודה לנטלי ג’ונסטון על ההקלטה של הצילומים הלא כירורגיים וכל עריכת הווידאו.
3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
Atropine suplhate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals – 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |