Incrementele temperatuurveranderingen voor maximale fokkerij en spawning in Astyanax mexicanus
Summary
Dit artikel beschrijft de basis laboratoriumomstandigheden en protocollen voor een incrementeel temperatuurregime om maximale spawning te stimuleren in de Mexicaanse tetra Astyanax mexicanus, een opkomend model voor ontwikkelings- en evolutionaire studies.
Abstract
De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus,is een opkomend modelsysteem voor studies in ontwikkeling en evolutie. Het bestaan van eyed surface (oppervlaktevissen) en blinde grot (grotvissen) morphs in deze soort biedt een kans om de mechanismen die ten grondslag liggen aan morfologische en gedragsevolutie te ondervragen. Grotvissen hebben nieuwe constructieve en regressieve eigenschappen ontwikkeld. De constructieve veranderingen omvatten verhogingen van smaakpapillen en kaken, laterale lijn zintuiglijke organen en lichaamsvet. De regressieve veranderingen omvatten verlies of vermindering van de ogen. melaninepigmentatie, schoolgedrag, agressie en slaap. Om deze veranderingen experimenteel te ondervragen, is het cruciaal om grote aantallen voortgebrachte embryo’s te verkrijgen. Sinds de oorspronkelijke A. mexicanus oppervlaktevissen en grotvissen in de jaren 1990 in Texas en Mexico werden verzameld, zijn hun nakomelingen routinematig gestimuleerd om tweemaandelijks grote aantallen embryo’s te fokken en te spawnen in het Jeffery-laboratorium. Hoewel fokken wordt gecontroleerd door voedselrijkdom en kwaliteit, licht-donkercycli en temperatuur, hebben we ontdekt dat incrementele temperatuurveranderingen een sleutelrol spelen bij het stimuleren van maximale spawning. De geleidelijke temperatuurstijging van 72 °F tot 78 °F in de eerste drie dagen van een broedweek biedt twee-drie opeenvolgende paaidagen met maximale aantallen embryo’s van hoge kwaliteit, die vervolgens wordt gevolgd door een geleidelijke daling van de temperatuur van 78 °F tot 72 °F tijdens de laatste drie dagen van de paaiweek. De procedures in deze video schetsen de workflow voor en tijdens een laboratoriumkweek voor incrementeel stimulerend paaien.
Introduction
Teleost Astyanax mexicanus heeft een eyed oppervlakte-woning (oppervlaktevissen) vorm en vele verschillende blinde hol-woning (holvissen) vormen1,2. Grotvissen zijn geëvolueerd in eeuwige duisternis en onder voedselbeperkingen, wat resulteert in het verschijnen van nieuwe constructieve en regressieve eigenschappen3. De constructieve eigenschappen omvatten verhogingen van smaakpapillen en kaakgrootte, sensorische organen van de laterale lijn en vetreserves. De regressieve eigenschappen omvatten het verlies of de vermindering van melaninepigmentatie, ogen en gedrag, zoals slaap, scholing en agressie. Een attribuut van het Astyanax-systeem is volledige vruchtbaarheid tussen de twee vormen, waardoor het gebruik van kwantitatieve eigenschap loci (QTL) mapping om de genomische regio(s) te bepalen die verband houden met constructieve en regressieve evolutie4,5,6,7. A. mexicanus biedt een voordelig systeem om ontwikkeling te bestuderen omdat het kan worden geïnduceerd om vaak in het laboratorium te spawnen. De embryo’s van A. mexicanus zijn doorschijnend, iets groter dan die van zebravissen, geproduceerd in grote hoeveelheden, en ontwikkelen zich tot geslachtsrijpe volwassenen in ongeveer 8-12 maanden. Hun maximale paaicapaciteit is ongeveer 5 jaar. Dit protocol beschrijft de workflow die nodig is in een A. mexicanus kweekfaciliteit tijdens een typische broedweek en bevat de details van het onderhoud van het vissysteem en het temperatuurregelingsregime voor maximaal paaien.
A. mexicanus is een tropische vis die leeft in rivieren afkomstig uit kalksteenplateaus (oppervlaktevissen) en in poelen in kalksteengrotten (grotvissen)8. Kalksteen lost op om hard water te produceren en A. mexicanus gedijt goed in hard water. Vissen die zijn aangepast aan harde wateromstandigheden kunnen een reeks zoute omstandigheden verdragen, maar broeden over het algemeen in specifiekeomstandigheden 9. Inductie van paaigedrag wordt bereikt door een combinatie van factoren. Omdat vissen koudbloedig zijn en afhankelijk zijn van hun omgeving om homeostase te behouden, is hun metabolisme gevoelig voor veranderingen in de omgeving en reageren ze sneller op stressoren10. A. mexicanus moet worden gekweekt in aquatische systemen onder zorgvuldig gereguleerde omstandigheden van waterstroom, pH, geleidbaarheid, osmotische druk, verlichting en watertemperaturen.
In het Jeffery-laboratorium worden vissen onderhouden in twee stromende watersystemen: (1) een “babysysteem” voor jongvolwassen vissen vóór geslachtsrijpheid en (2) een volwassen (of hoofd)systeem voor seksueel volwassen, fokkende volwassenen. Het “babysysteem” bestaat uit tanks van 8 L en 15 L die van stromend water worden voorzien. Het “babysysteem” wordt gezaaid door jongen en jonge gemetamorfiseerde juvenielen gekweekt uit larven in kleinere (1-10 L) tanks, waarin wekelijks water wordt uitgewisseld. Larven, jongen en juvenielen zijn extreem voedselafhankelijk en moeten eenmaal per dag levend voedsel (pekelgarnalen) krijgen om een hoge overlevingskans te garanderen. Jonge jongeren uit het “babysysteem” worden na ongeveer 1-1,5 jaar in het volwassen systeem geplaatst. In het begin worden ze verpulverde tetravlokken gevoerd en na verdere groei worden ze overgebracht naar het reguliere voedingsregime voor volwassenen. Seksuele rijpheid kan worden beoordeeld aan de hand van het abdominale volume bij vrouwen, en methoden voor het bepalen van het geslacht zijn beschreven11. In het volwassen systeem wordt water automatisch uitgewisseld in tanks van 42 L 3 keer per periode van 24 uur. Het volwassen systeem wordt dagelijks bewaakt door visuele inspectie en automatische temperatuur-, pH- en geleidbaarheidsmetingen van sondes. De optimale pH ligt rond de 7,4 en kan variëren tussen 6,8-7,5, de basistemperatuur van het systeem is 72/73 °F en de ideale geleidbaarheid varieert tussen 600-800 mS. Automatische metingen worden weergegeven op een controllerscherm en visuele controles van de waterdruk worden afgelezen op stromingsmeters verdeeld over het systeem. Onafhankelijke controles op de waterkwaliteit worden wekelijks uitgevoerd door de temperatuur te testen en waterkwaliteitsparameters voor pH, ammoniak en nitraat te meten met behulp van een colorimetrische test. Ammoniak- en nitraatgehalten worden op of dicht bij nul gehouden door nuttige bacteriën (bijv. Nutafin Cycle) aan het systeem toe te voegen. De kamerverlichting wordt geregeld door een timer die is ingesteld op 14-uurs licht en 10-uurs donkere perioden. Naast de hierboven genoemde algemene waterkwaliteitsparameters hebben de volgende overwegingen speciale aandacht nodig tijdens een broedweek.
De eerste overweging is fotoperiode, omdat vissen (zelfs grotvissen in het laboratorium) afhankelijk zijn van lichtcycli om hun circadiane klok in te stellen. Circadiaanse ritmes kunnen van invloed zijn op alles, van fokken en voeden tot de gezondheid van het immuunsysteem12,13 en moeten consistent zijn voor maximale gezondheidsvoordelen. Vissen worden onderhouden in een stromend watersysteem op een 14-uurs lichte en 10-uur donkere fotoperiode. De oppervlaktevissen beginnen over het algemeen een uur nadat het systeem is verduisterd te paaien en licht dat tijdens deze periode wordt geïntroduceerd, kan het paaien verstoren en beëindigen. Het paaien van blinde grotvissen wordt minder verstoord door licht. In vergelijking met het paaien van oppervlaktevissen wordt het paaien van grotvissen vertraagd, meestal vier tot vijf uur nadat het systeem is verduisterd.
De tweede overweging is voeding. Volwassen vissen krijgen normaal gesproken eenmaal per dag een dieet van tetravlokken. Voorafgaand aan het paaien krijgen vissen een eiwitrijk dieet, aangevuld met extra hoeveelheden tetravlokken en ander voedsel: eigeelvlokken en af en toe levende Californische zwartwormen(Lumbriculus variegatus)om eiwitverlies als gevolg van eierproductie tijdens de vorige paaicyclus te compenseren. Tijdens de broedweek worden vissen twee keer per dag gevoerd, eenmaal ‘s ochtends en opnieuw in de middag/avond. Visvoeding slechts één keer per dag, maar met een enkele zeer grote portie voedsel moet worden vermeden, omdat dit ondervoeding kan veroorzaken14.
De derde overweging is ruimte. De ruimtevereisten zijn gebaseerd op de gemiddelde lichaamsmassa van een volwassene en gedragsoverwegingen, zoals of de vissen scholingsgedrag of agressief gedrag hebben. Over- of onderbemengende tanks kunnen leiden tot verhoogde agressie en constante stress, waardoor vissen kwetsbaar zijn voor verwondingen van hun tankmaten en terughoudend zijn om deel te nemen aan het paaien15. We huisvesten meestal 10-20 vissen per 42 L tank.
De vierde overweging is temperatuur. Zoals hierboven vermeld, zijn vissen koudbloedige dieren en vertrouwen ze op de omgeving om de lichaamstemperatuur te handhaven. Omdat temperatuur een direct effect heeft op metabolische processen, kunnen temperatuurveranderingen gedragsveranderingen bij vissen veroorzaken16. Dit fokprogramma bestaat uit cycli van twee weken in temperatuur: de eerste week introduceert een temperatuurpiek tot 78 °F en de volgende week handhaaft een statische temperatuur van 72 °F. Tijdens de eerste (kweek)week worden er elke avond plastic-edged foknetten op de bodem van de tanks geplaatst. De broednetten dienen als een barrière tussen de vissen in de tanks en de gebroede eieren, die anders zouden worden geconsumeerd. De temperatuur wordt verhoogd met 2 °F per dag tot een maximum van 78 °F tegen het midden van de week, en paaien wordt geïnduceerd volgens de lichtcyclus in de eerste 2-3 avonden van deze week. De temperatuur wordt vervolgens tijdens de resterende dagen van de week met stappen van 2 °F verlaagd tot 72 °F en de basistemperatuur wordt gehandhaafd tot het begin van de volgende broedweek. Fokken wordt meestal niet meer dan twee keer per maand gestimuleerd om de vis de tijd te geven om te herstellen.
Over het algemeen maakt deze methode het mogelijk om grote hoeveelheden embryo’s van de hoogste kwaliteit over een langere periode te paaien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astyanax mexicanus is een nieuw biologisch model dat vaak spawnt en gemakkelijk kan worden gefokt in het laboratorium1,2. Omdat we geïnteresseerd zijn in de ontwikkelingsmechanismen die ten grondslag liggen aan evolutionaire veranderingen in A. mexicanus grotvissen, is de productie en het gebruik van embryo’s van vitaal belang voor onze onderzoeksdoelen. Het primaire doel van het behoud van een volwassen visbestand is de productie van embryo’s …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote en Mandy Ng voor waardevolle bijdragen aan de Jeffery laboratorium A. mexicanus cultuur faciliteit. Het onderzoek in het Jeffery laboratorium wordt momenteel ondersteund door NIH subsidie EY024941.
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. 发育生物学. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O’Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. . Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. . In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. 发育生物学. 441, 313-318 (2018).
