Cambios incrementales de temperatura para la cría y el desove máximos en Astyanax mexicanus
Summary
Este artículo describe las condiciones básicas de laboratorio y los protocolos para un régimen de temperatura incremental para estimular el desove máximo en el tetra mexicano Astyanax mexicanus,que es un modelo emergente para los estudios de desarrollo y evolutivos.
Abstract
El tetra mexicano, Astyanax mexicanus, es un sistema modelo emergente para estudios en desarrollo y evolución. La existencia de morfos de superficie ocular (peces de superficie) y de cueva ciega (peces de cueva) en esta especie presenta una oportunidad para interrogar los mecanismos subyacentes a la evolución morfológica y conductual. Los peces de las cavernas han desarrollado nuevos rasgos constructivos y regresivos. Los cambios constructivos incluyen aumentos en las papilas gustativas y mandíbulas, órganos sensoriales de línea lateral, y la grasa corporal. Los cambios regresivos incluyen pérdida o reducción de los ojos. pigmentación de la melanina, comportamiento de la escolaridad, agresión, y sueño. Para interrogar experimentalmente estos cambios, es crucial obtener un gran número de embriones desovados. Desde que los peces de superficie originales de A. mexicanus y los peces de cueva se recolectaron en Texas y México en la década de 1990, sus descendientes han sido estimulados rutinariamente para reproducir y desovar grandes cantidades de embriones bimestralmente en el laboratorio Jeffery. Aunque la cría está controlada por la abundancia y calidad de los alimentos, los ciclos claros y oscuros y la temperatura, hemos encontrado que los cambios incrementales de temperatura juegan un papel clave en la estimulación del desove máximo. El aumento gradual de la temperatura de 72 ° F a 78 ° F en los primeros tres días de una semana de reproducción proporciona dos o tres días consecutivos de desove con un número máximo de embriones de alta calidad, que luego es seguido por una disminución gradual de la temperatura de 78 ° F a 72 ° F durante los últimos tres días de la semana de desove. Los procedimientos que se muestran en este video describen el flujo de trabajo antes y durante una semana de cría de laboratorio para el desove estimulado por la temperatura incremental.
Introduction
El teleósteo Astyanax mexicanus tiene una forma de vivienda superficial ocular (peces de superficie) y muchas formas diferentes de viviendas de cuevas ciegas (peces de cueva)1,2. Los peces de las cavernas han evolucionado en la oscuridad perpetua y bajo limitaciones alimentarias, dando lugar a la aparición de nuevos rasgos constructivos y regresivos3. Los rasgos constructivos incluyen aumentos en las papilas gustativas y el tamaño de la mandíbula, los órganos sensoriales de la línea lateral y las reservas de grasa. Los rasgos regresivos incluyen la pérdida o reducción de la pigmentación de melanina, los ojos y los comportamientos, como el sueño, la escolarización y la agresión. Un atributo del sistema Astyanax es la fertilidad completa entre las dos formas, lo que permite el uso de mapeo cuantitativo de loci de rasgos (QTL) para determinar la(s) región(es) genómica(s) asociada(s) con la evolución constructiva y regresiva4,5,6,7. A. mexicanus ofrece un sistema ventajoso para estudiar el desarrollo porque puede ser inducido a desovar con frecuencia en el laboratorio. Los embriones de A. mexicanus son translúcidos, ligeramente más grandes que los del pez cebra, producidos en grandes cantidades, y se convierten en adultos sexualmente maduros en aproximadamente 8-12 meses. Su período de máxima capacidad de desove es de aproximadamente 5 años. Este protocolo describe el flujo de trabajo necesario en una instalación de cultivo de A. mexicanus durante una semana de reproducción típica e incluye los detalles del mantenimiento del sistema de peces y el régimen de control de temperatura para el desove máximo.
A. mexicanus es un pez tropical que vive en ríos que se originan en mesetas calizas (peces de superficie) y en piscinas en cuevas de piedra caliza (peces de cueva)8. La piedra caliza se disuelve para producir agua dura, y A. mexicanus prospera en agua dura. Los peces adaptados a las condiciones de las aguas duras pueden tolerar una serie de condiciones saladas, pero generalmente se reproducen en condiciones específicas9. La inducción del comportamiento de desove se logra mediante una combinación de factores. Debido a que los peces son de sangre fría y dependen de su entorno para mantener la homeostasis, su metabolismo es sensible a los cambios ambientales y reaccionan más rápidamente a los factores estresantes10. A. mexicanus debe cultivarse en sistemas acuáticos bajo condiciones cuidadosamente reguladas de flujo de agua, pH, conductividad, presión osmótica, iluminación y temperaturas del agua.
En el laboratorio Jeffery, los peces se mantienen en dos sistemas de agua corriente: (1) un “sistema bebé” para peces adultos jóvenes antes de la madurez sexual y (2) un sistema adulto (o principal) para adultos sexualmente maduros, reproductores. El “sistema para bebés” consta de tanques de 8 L y 15 L suministrados con agua corriente. El “sistema bebé” es sembrado por alevines y juveniles metamorfoseados jóvenes cultivados a partir de larvas en tanques más pequeños (1-10 L), en los que el agua se intercambia semanalmente. Las larvas, alevines y juveniles son extremadamente dependientes de los alimentos y deben ser alimentados con alimentos vivos (camarones de salmuera) una vez al día para garantizar una alta tasa de supervivencia. Los jóvenes del “sistema del bebé” se colocan en el sistema adulto después de aproximadamente 1-1,5 años. Al principio, se alimentan con tetra escamas pulverizadas, y después de un mayor crecimiento se transfieren al régimen regular de alimentación de adultos. La madurez sexual puede ser evaluada por el volumen abdominal en las hembras, y se han descrito métodos para determinar el sexo11. En el sistema adulto, el agua se intercambia automáticamente en tanques de 42 L 3 veces por período de 24 horas. El sistema adulto es monitoreado diariamente por inspección visual y lecturas automáticas de temperatura, pH y conductividad de las sondas. El pH óptimo es de alrededor de 7.4 y puede oscilar entre 6.8-7.5, la temperatura base del sistema es de 72/73 ° F, y la conductividad ideal oscila entre 600-800 mS. Las lecturas automáticas se muestran en una pantalla del controlador y las comprobaciones visuales de la presión del agua se leen en los medidores de flujo distribuidos por todo el sistema. Semanalmente se realizan controles independientes de la calidad del agua mediante pruebas de temperatura y la medición de los parámetros de calidad del agua para el pH, el amoníaco y el nitrato mediante una prueba colorimétrica. Los niveles de amoníaco y nitrato se mantienen en o cerca de cero mediante la adición de bacterias beneficiosas (por ejemplo, ciclo de Nutafin) al sistema. La iluminación de la habitación se controla mediante un temporizador ajustado a los períodos de luz de 14 horas y oscuridad de 10 horas. Además de los parámetros generales de calidad del agua mencionados anteriormente, las siguientes consideraciones necesitan especial atención durante una semana de cría.
La primera consideración es el fotoperiodo, ya que los peces (incluso los peces de cueva en el laboratorio) dependen de los ciclos de luz para establecer su reloj circadiano. Los ritmos circadianos pueden afectar a todo, desde la cría y la alimentación hasta la salud del sistema inmunológico12,13 y deben ser consistentes para obtener los máximos beneficios para la salud. Los peces se mantienen en un sistema de agua corriente en un fotoperiodo de luz de 14 horas y 10 horas de oscuridad. Los peces de superficie generalmente comienzan a desovar una hora después de que el sistema se ha oscurecido, y la luz introducida durante este período puede interferir y terminar el desove. El desove de peces ciegos de cueva es menos perturbado por la luz. En comparación con el desove de peces de superficie, el desove de peces de cueva se retrasa, generalmente comenzando de cuatro a cinco horas después de que el sistema se haya oscurecido.
La segunda consideración es la nutrición. Los peces adultos normalmente son alimentados con una dieta de tetra escamas una vez al día. Antes del desove, los peces son alimentados con una dieta rica en proteínas complementada con cantidades adicionales de tetra copos y otros alimentos: copos de yema de huevo y ocasionalmente gusanos negros de California vivos(Lumbriculus variegatus)para compensar la pérdida de proteínas debido a la producción de huevos durante el ciclo de desove anterior. Durante la semana de reproducción, los peces son alimentados dos veces al día, una vez por la mañana y otra vez por la tarde/noche. Se debe evitar que los peces se alimenten una sola vez al día pero con una sola porción muy grande de alimento, ya que esto puede causar desnutrición14.
La tercera consideración es el espacio. Los requisitos de espacio se basan en la masa corporal promedio de un adulto, así como en consideraciones de comportamiento, como si los peces tienen un comportamiento escolar o agresivo. Los tanques que están sobre o poco hacinados pueden conducir a una mayor agresión y estrés constante, lo que hace que los peces sean vulnerables a las lesiones de sus compañeros de tanque y reacios a participar en el desove15. Normalmente albergamos 10-20 peces por tanque de 42 L.
La cuarta consideración es la temperatura. Como se mencionó anteriormente, los peces son animales de sangre fría y dependen del medio ambiente para mantener la temperatura corporal. Debido a que la temperatura tiene un efecto directo en los procesos metabólicos, los cambios de temperatura pueden desencadenar alteraciones de comportamiento en los peces16. Este programa de reproducción consiste en ciclos de temperatura de dos semanas: la primera semana introduce un pico de temperatura a 78 ° F, y la semana siguiente mantiene una temperatura estática de 72 ° F. Durante la primera semana (de cría), las redes de cría con bordes de plástico se colocan en el fondo de los tanques cada noche. Las redes de cría sirven como una barrera entre los peces en los tanques y los huevos desovados, que de otro modo se consumirían. La temperatura se eleva en 2 ° F por día a un máximo de 78 ° F a mediados de semana, y el desove se induce de acuerdo con el ciclo de luz en las primeras 2-3 noches de esta semana. La temperatura se reduce en incrementos de 2 ° F a 72 ° F durante los días restantes de la semana, y la temperatura base se mantiene hasta el comienzo de la próxima semana de reproducción. La cría generalmente se estimula no más de dos veces al mes para permitir que los peces se recuperen.
En general, este método permite el desove de grandes cantidades de embriones de la más alta calidad durante un período de tiempo más largo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astyanax mexicanus es un nuevo modelo biológico que desova con frecuencia y se puede criar fácilmente en el laboratorio1,2. Debido a que estamos interesados en los mecanismos de desarrollo que subyacen a los cambios evolutivos en los peces de la cueva de A. mexicanus, la producción y el uso de embriones es vital para nuestros objetivos de investigación. El objetivo principal del mantenimiento de una población adulta de peces es la producci?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote y Mandy Ng por sus valiosas contribuciones a las instalaciones de cultura A. mexicanus del laboratorio Jeffery. La investigación en el laboratorio Jeffery está actualmente respaldada por la subvención EY024941 de los NIH.
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
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