Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

Summary

Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.

Abstract

Os cânceres colorretais são caracterizados pela heterogeneidade e uma organização hierárquica composta por uma população de células-tronco cancerígenas (CSCs) responsáveis pelo desenvolvimento do tumor, manutenção e resistência aos fármacos. Uma melhor compreensão das propriedades do CSC para seu direcionamento específico é, portanto, um pré-requisito para uma terapia eficaz. No entanto, há uma escassez de modelos pré-clínicos adequados para investigações aprofundadas. Embora as linhas de células cancerígenas in vitro bidimensionais (2D) forneçam insights valiosos sobre a biologia tumoral, elas não replicam a heterogeneidade fenotípica e genética do tumor. Em contraste, modelos tridimensionais (3D) abordam e reproduzem a complexidade do câncer quase fisiológico e a heterogeneidade celular. O objetivo deste trabalho foi projetar um sistema de cultura 3D robusto e reprodutível para estudar biologia CSC. A presente metodologia descreve o desenvolvimento e otimização das condições para a geração de esferoides 3D, que são homogêneos em tamanho, a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2, modelo que pode ser utilizado para a cultura de longo prazo. É importante ressaltar que, dentro dos esferoides, as células que se organizavam em torno de estruturas semelhantes ao lúmen, foram caracterizadas por padrões diferenciais de proliferação celular e pela presença de CSCs expressando um painel de marcadores. Esses resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação desta abordagem 3D para estudar heterogeneidade celular e biologia CSC, incluindo a resposta à quimioterapia.

Introduction

O câncer colorretal (CRC) continua sendo a segunda principal causa de mortes associadas ao câncer no mundo¹. O desenvolvimento do CRC é resultado de uma progressiva aquisição e acúmulo de mutações genéticas e/ou alterações epigenéticas^2,3, incluindo a ativação de oncogenes e a inativação dos genes supressores tumorais^3,4. Além disso, fatores não genéticos (por exemplo, o microambiente) podem contribuir e promover a transformação oncogênica e, assim, participar da evolução dos CRCs⁵. É importante ressaltar que os CRCs são compostos por diferentes populações celulares, incluindo CSCs indiferenciados e células tumorais a granel exibindo alguns traços de diferenciação, que constituem uma estrutura hierárquica que lembra a organização do epitélio em uma cripta normal de cólon^6,7.

Os CSCs são considerados responsáveis pela aparência do tumor^8,sua manutenção e crescimento, capacidade metastática e resistência às terapias convencionais^6,7. Dentro dos tumores, as células cancerígenas, incluindo os CSCs, apresentam um alto nível de heterogeneidade e complexidade em termos de seus distintos perfis mutacionais e epigenéticos, diferenças morfológicas e fenotípicas, expressão genética, metabolismo, taxas de proliferação e potencial metastático⁹. Portanto, para entender melhor a biologia do câncer, a progressão do tumor e a aquisição da resistência à terapia e sua tradução para tratamentos eficazes, modelos pré-clínicos humanos que capturam essa heterogeneidade e hierarquia do câncer são importantes^10,11.

As linhas in vitro de células cancerígenas 2D têm sido usadas há muito tempo e fornecem insights valiosos sobre o desenvolvimento do tumor e os mecanismos subjacentes à eficácia das moléculas terapêuticas. No entanto, sua limitação em relação à falta da heterogeneidade fenotípica e genética encontrada nos tumores originais é agora amplamente reconhecida¹². Além disso, nutrientes, oxigênio, gradientes de pH e o microambiente tumoral não são reproduzidos, sendo o microambiente especialmente importante para a manutenção de diferentes tipos celulares, incluindo CSCs^11,12. Para superar essas principais desvantagens, vários modelos 3D foram desenvolvidos para abordar experimentalmente e reproduzir a complexidade e heterogeneidade dos cânceres. Com efeito, esses modelos recapitulam a heterogeneidade celular tumoral, interações células celulares e arquitetura espacial, semelhantes às observadas in vivo^12,13,14. Os organoides tumorais primários estabelecidos a partir de tumores frescos, bem como esferoides derivados de linhas celulares, são em grande parte empregados^15,16.

Esferoides podem ser cultivados de uma maneira livre de andaimes ou baseados em andaimes para forçar as células a se formarem e crescerem em agregados celulares. Os métodos livres de andaimes baseiam-se na cultura das células em condições não aderentes (por exemplo, o método de queda suspensa ou placas de fixação ultra-baixas), enquanto os modelos baseados em andaimes dependem de biomateriais naturais, sintéticos ou híbridos para células culturais^12,13,14. Os esferoides à base de andaimes apresentam diferentes desvantagens, pois a formação final de esferoides dependerá da natureza e composição do (bio)material utilizado. Embora os métodos esferoides livres de andaimes disponíveis até agora não dependam da natureza do substrato, eles geram esferoides que variam em estrutura e tamanho^17,18.

Este trabalho teve como objetivo projetar um robusto e reprodutível sistema de cultura 3D de esferoides, que são homogêneos em tamanho, composto por células de adenocarcinoma de cólon caco2 para estudar biologia CSC. As células caco2 são de particular interesse devido à sua capacidade de diferenciar ao longo do tempo^19,20, sugerindo fortemente um potencial semelhante a uma haste. Assim, a cultura de longo prazo dos esferoides revelou a presença de diferentes populações de CSC com diferentes respostas à quimioterapia.

Protocol

NOTA: Os detalhes de todos os reagentes e materiais estão listados na Tabela de Materiais. 1. Formação esferoide Mídia de cultura esféide Prepare o meio basal composto pelo DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco, complementado com dipeptida l-alanyl-L-glutamina de 4 mM. Prepare o MDM MÉDIO completo contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (Pen/Estreptomicina) em meio basal a partir da…

Representative Results

Como a falta de homogeneidade no tamanho dos esferoides é uma das principais desvantagens dos sistemas de cultura 3D3D 13disponíveis atualmente, o objetivo deste trabalho foi criar um protocolo confiável e reprodutível para obter spheroids homogêneos. Primeiro, para estabelecer condições ideais de trabalho, foram testados diferentes números de células Caco2, variando de 50 a 2.000 células por microwell/esferoide utilizando placas dedicadas(Tabela …

Discussion

Modelos 3D in vitro superam as principais desvantagens experimentais das culturas de células cancerígenas 2D, pois parecem ser mais confiáveis na recapitulação de características tumorais típicas, incluindo microambiente e heterogeneidade celular. Modelos 3D comumente usados de esferoides são livres de andaimes (cultivados em condições de baixa fixação) ou baseados em andaimes (usando biomateriais para células de cultura). Esses métodos apresentam diferentes desvantagens, pois dependem da natureza do andaim…

Materials

37 µm Reversible Strainer, Large	STEMCELL Technologies	27250	To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil	Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)	–	stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-well plates	STEMCELL Technologies	34411	1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 – Rabbit	Cell Signaling	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) – Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) – Rat	Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA – Mouse	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-β-catenin – Mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Black multiwell plates	Thermo Fisher Scientific	237108
Citric Acid Monohydrate	Sigma	C1909
CLARIOstar apparatus	BMG Labtech		microplate reader
Dako pen			marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI	Interchim	FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
ImageJ software			Spheroid image analysis
Irinotecan	Gift from Pharmacy CLB	–	stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy CLB	–	stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Gift from Pharmacy CLB	–	stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert microscope			inverted microscope for acquiring images of spheroids