Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon
Summary
Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.
Abstract
Los cánceres colorrectales son caracterizados por heterogeneidad y una organización jerárquica que comprende una población de las células madres del cáncer (CSCs) responsables del desarrollo, del mantenimiento, y de la resistencia del tumor a las drogas. Una mejor comprensión de las propiedades de CSC para su orientación específica es, por lo tanto, un requisito previo para la terapia efectiva. Sin embargo, hay una escasez de modelos preclínicos adecuados para investigaciones en profundidad. Aunque las variedades de células bidimensionales ines vitro (2D) del cáncer proporcionen penetraciones valiosas en biología del tumor, no replican la heterogeneidad fenotípica y genética del tumor. Por el contrario, los modelos tridimensionales (3D) abordan y reproducen la complejidad casi fisiológica del cáncer y la heterogeneidad celular. El objetivo de este trabajo fue diseñar un sistema de cultivo 3D robusto y reproducible para estudiar la biología csc. La presente metodología describe el desarrollo y optimización de condiciones para generar esferoides 3D, de tamaño homogéneo, a partir de células de adenocarcinoma de colon Caco2, un modelo que puede ser utilizado para el cultivo a largo plazo. Importantemente, dentro de los esferoides, las células que fueron organizadas alrededor lumen-como las estructuras, fueron caracterizadas por los patrones diferenciados de la proliferación de célula y por la presencia de CSCs que expresaban un panel de marcadores. Estos resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque 3D para estudiar la heterogeneidad celular y la biología csc, incluyendo la respuesta a la quimioterapia.
Introduction
El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo la segunda causa principal de muertes asociadas al cáncer en el mundo1. El desarrollo de la CCR es el resultado de una progresiva adquisición y acumulación de mutaciones genéticas y/o alteraciones epigenéticas2,3,incluyendo la activación de oncogenes e inactivación de genes supresores tumorales3,4. Además, los factores no genéticos (por ejemplo, el microambiente) pueden contribuir y promover la transformación oncogénica y, por lo tanto, participar en la evolución de los CCR5. Es importante destacar que los CRCs están compuestos por diferentes poblaciones celulares, incluyendo CSCs indiferenciados y células tumorales a granel que muestran algunos rasgos de diferenciación, que constituyen una estructura jerárquica que recuerda a la organización del epitelio en una cripta normal del colon6,7.
Se considera que las CSCs son responsables de la aparición del tumor8,su mantenimiento y crecimiento, capacidad metastásica y resistencia a las terapias convencionales6,7. Dentro de los tumores, las células cancerosas, incluidas las CSCs, muestran un alto nivel de heterogeneidad y complejidad en términos de sus distintos perfiles mutacionales y epigenéticos, diferencias morfológicas y fenotípicas, expresión génica, metabolismo, tasas de proliferación y potencial metastásico9. Por lo tanto, para comprender mejor la biología del cáncer, la progresión tumoral y la adquisición de resistencia a la terapia y su traducción en tratamientos efectivos, los modelos preclínicos humanos que capturan esta heterogeneidad y jerarquía del cáncer son importantes10,11.
Las variedades de células ines vitro del cáncer 2D se han utilizado durante mucho tiempo y proporcionan penetraciones valiosas en el desarrollo del tumor y los mecanismos que son la base de la eficacia de moléculas terapéuticas. Sin embargo, su limitación con respecto a la falta de heterogeneidad fenotípica y genética encontrada en los tumores originales es ahora ampliamente reconocida12. Por otra parte, los nutrientes, el oxígeno, los gradientes de pH y el microambiente tumoral no se reproducen, siendo el microambiente especialmente importante para el mantenimiento de diferentes tipos celulares, incluidas las CSCs11,12. Para superar estos principales inconvenientes, se han desarrollado varios modelos 3D para abordar y reproducir experimentalmente la complejidad y heterogeneidad de los cánceres. En efecto, estos modelos recapitulan la heterogeneidad celular tumoral, las interacciones célula-célula y la arquitectura espacial, similares a las observadas in vivo12,13,14. Los organoides tumorales primarios establecidos a partir de tumores frescos, así como los esferoides derivados de líneas celulares, se emplean en gran medida15,16.
Los esferoides se pueden cultivar de una manera libre de andamios o basada en andamios para forzar a las células a formarse y crecer en agregados celulares. Los métodos libres de andamios se basan en el cultivo de células en condiciones no adherentes (por ejemplo, el método de colgar y soltar o placas de fijación ultrabajos), mientras que los modelos basados en andamios se basan en biomateriales naturales, sintéticos o híbridos para cultivar células12,13,14. Los esferoides basados en andamios presentan diferentes desventajas, ya que la formación final del esferoide dependerá de la naturaleza y composición del (bio)material utilizado. Aunque los métodos de esferoides sin andamios disponibles hasta ahora no se basan en la naturaleza del sustrato, generan esferoides que varían en estructura y tamaño17,18.
Este trabajo tuvo como objetivo diseñar un sistema de cultivo 3D robusto y reproducible de esferoides, de tamaño homogéneo, compuesto por células de adenocarcinoma de colon Caco2 para estudiar la biología csc. Las células Caco2 son de particular interés debido a su capacidad para diferenciarse con el tiempo19,20,lo que sugiere fuertemente un potencial similar al tallo. Por consiguiente, la cultura de largo plazo de los esferoides reveló la presencia de diversas poblaciones del CSC con diversas respuestas a la quimioterapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los modelos 3D in vitro superan los principales inconvenientes experimentales de los cultivos celulares de cáncer 2D, ya que parecen ser más confiables para recapitular las características tumorales típicas, incluido el microambiente y la heterogeneidad celular. Los modelos 3D de esferoides comúnmente utilizados son libres de andamios (cultivados en condiciones de baja unión) o basados en andamios (utilizando biomateriales para cultivar células). Estos métodos presentan diferentes desventajas ya que dependen de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos las plataformas de la histología de la proyección de imagen y del recherche del anípata (CRCL, CLB). Estamos en deuda con la farmacia del Hospital Centre Léon Bérard (CLB) por el amable regalo de FOLFOX y FOLFIRI. También agradecemos a Brigitte Manship por la lectura crítica del manuscrito. El trabajo fue apoyado por el FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) y por el Inca (PLBIO19-289). MVG y LC recibieron apoyo del FRM y CF recibieron apoyo de la fundación ARC y del Centre Léon Bérard.
Materials
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
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