RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

Summary

このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。

Abstract

内臓脂肪組織(VAT)は、主に成熟脂肪細胞と間質血管分(SVF)細胞で構成される活発な代謝器官であり、代謝、ホルモン、および免疫プロセスを制御するさまざまな生理活性分子を放出します。現在のところ、これらのプロセスが脂肪組織内でどのように制御されているかは不明です。したがって、脂肪組織の病態生理学に対する各細胞集団の寄与を評価する方法の開発は非常に重要です。このプロトコルでは、単離手順を説明し、コラゲナーゼ酵素消化技術を使用して、単一のプロセスでヒトVAT生検から生存可能な成熟脂肪細胞およびSVFを効率的に分離するために必要なトラブルシューティングガイドラインを提供します。さらに、プロトコルはまたマクロファージのサブセットを識別し、これらのセル集団間の相互作用を解剖する調査を行うことを可能にする遺伝子発現の調査のための成熟した脂肪細胞のRNAの隔離を行うために最大限に活用される。簡単に言うと、VAT生検を洗浄し、機械的に細かく刻み、消化して単一細胞懸濁液を生成します。遠心分離後、成熟脂肪細胞は浮遊選鉱によりSVFペレットから単離されます。RNA抽出プロトコルは、下流の発現アッセイのために脂肪細胞からの総RNA(miRNAを含む)の高収率を保証します。同時に、SVF細胞を使用して、フローサイトメトリー解析を通じてマクロファージサブセット(炎症誘発性および抗炎症性表現型)を特徴付けます。

Introduction

白色脂肪組織は、脂肪細胞や脂肪細胞だけでなく、マクロファージ、制御性T細胞(Treg)としての免疫細胞、好酸球、前駆脂肪細胞、線維芽細胞からなる不均一な細胞集団を含む間質血管分画(SVF)と呼ばれる非脂肪細胞分画で構成されており、血管組織や結合組織に囲まれています^1,2。.現在、脂肪組織(AT)は、アディポカイン、サイトカイン、マイクロRNAを介して代謝と炎症に関連する生理学的プロセスを調節する器官と見なされており、さまざまな細胞によって組織に生成および放出され、自己分泌、パラクリン、および内分泌の影響を受けます^3,4。ヒトでは、白色脂肪組織は皮下脂肪組織(SAT)と内臓脂肪組織(VAT)で構成され、それらの間には重要な解剖学的、分子的、細胞的、および生理学的違いがあります^2,5。SATはヒトのATの最大80%を占めていますが、VATは腹腔内、主に腸間膜と大網にあり、代謝的により活発です⁶。さらに、VATはメディエーターを分泌する内分泌器官であり、体重、インスリン感受性、脂質代謝、炎症に大きな影響を与えます。その結果、VATの蓄積は、腹部肥満や、2型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血圧、心血管疾患リスクなどの肥満関連疾患につながり、肥満関連死亡率のより良い予測因子となります^6,7,8,9。

恒常性維持状態では、脂肪細胞、マクロファージ、およびその他の免疫細胞が協力して、抗炎症メディエーターの分泌を介してVAT代謝を維持します¹⁰。しかし、VATを過度に拡大すると、活性化T細胞、NK細胞、マクロファージの動員が促進されます。実際、除脂肪VATでは、マクロファージの比率は5%ですが、肥満ではこの比率が最大50%まで上昇し、マクロファージが抗炎症性から炎症誘発性の表現型に二極化し、慢性炎症環境を生成します^10,11。

肥満のパンデミックの結果として、脂肪細胞生物学、エピジェネティクス、炎症、内分泌特性、細胞外小胞などの新興領域など、さまざまなVAT研究トピックを扱う驚くべき数の報告が発生しています^8,10,12,13。しかし、VAT環境は脂肪細胞と常在マクロファージまたは到着マクロファージとの間のクロストークによって定義されますが、ほとんどの研究は1つの細胞集団のみに焦点を当てており、VATにおけるこれらの細胞の相互作用とその病態生理学的影響に関する情報はほとんどありません^11,14。さらに、ATにおける脂肪細胞とマクロファージの相互作用に対処する貴重な研究は、in vivoプライミング条件を欠いた細胞株を使用して行われました11,14,15。VATにおけるこれらの細胞の相互作用または特定の寄与を解剖する適切な戦略では、VAT代謝を調節するin vivo特性を可能な限り類似したin vitroアッセイを実施するために、同じ脂肪生検から両方の細胞タイプを単離する必要があります。

ATを破壊する機械的力に基づく非酵素的解離法は、最小限の操作を保証しますが、酵素法と比較して細胞回収効率が低く、細胞生存率が低く、より多くの組織が必要になるため、SVF細胞を研究することを目的としている場合は使用できません^16,17。.コラゲナーゼを用いた酵素消化は、WAT¹⁸などの線維組織のコラーゲンや細胞外マトリックスタンパク質を適切に消化できる穏やかな方法であり、トリプシンが効果がない、または損傷を与える場合によく使用される¹⁹。プロトコルはコラゲナーゼの酵素の消化力の技術を使用して単一のプロセスの人間のVATのバイオプシーから実行可能な成長した脂肪細胞そしてSVFのセルの有効な隔離のための基本的なトラブルシューティングの指針を、与える下流の表現の適用のためのmicroRNAsを含む成長した脂肪細胞からの総RNAの高収率(量、純度および完全性)を、保障するために情報を提供する。同時に、プロトコルは、フローサイトメ^トリー20によるさらなる分析のために、複数の膜結合マーカーの染色を通じてSVF細胞からのマクロファージサブセットを識別するように最適化されています。

Protocol

このプロトコルは、Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15) の IRB によって承認されました。参加は任意であり、登録されたすべての女性がインフォームドコンセントフォームに署名しました。 1. 内臓脂肪組織採取 分娩のない正期産の単胎妊娠の健康な成人女性から帝王切開中の部分的大網切除術を通じてVAT生検を取得します。 子宮閉鎖と止血の後…

Representative Results

このプロトコルは部分的なomentectomyの後で健康な妊婦から得られるVATのバイオプシーから、単一のプロセスで、実行可能な成熟した脂肪細胞およびSVFのセルを隔離するために差動遠心分離に続くコラゲナーゼの消化力を使用して酵素方法を記述する。この場合、RNA抽出には脂肪細胞を、マクロファージ表現型にはSVFを使用します。 RNA抽出プロトコルにより、成熟脂肪細胞…

Discussion

VATは、代謝調節と炎症に重要な役割を果たします。肥満に伴う慢性炎症における脂肪細胞と免疫細胞の役割への関心の高まりにより、ATに存在するSVF細胞と脂肪細胞を分離するためのさまざまな技術が開発されています。しかし、ほとんどの技術では、脂肪細胞とSVF細胞の相互作用に関する研究に不可欠な、同じVAT生検から下流のアプリケーションに有効なこれら2つの異なる細胞セットを1回…

Materials

0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes	Corning	CLS4101-50EA	Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-L-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-R-S	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip	Axygen	T-1000-B-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip	Axygen	T-200-Y-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	–
2101 Bioanalyzer PC	Agilent	G2953CA	2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube	Corning	352003	Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes	Corning	CLS430828-100EA	Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent	Zymo Research	R2050-1-200	TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	–
Agilent Small RNA Kit	Agilent	5067-1548	–
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody	BioLegend	325620	0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker	–	–	250 ml, non sterile
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station	Agilent	5065-9951	–
Collagenase type II	Gibco	17101-015	Powder
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Powder
Direct-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps	–	–	Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray	–	–	Stainless steel
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	–
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	–
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter	BD Biosciences	648282	–
FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA	–
Manual cell counter	–	–	–
Mayo dissecting scisors	–	–	Stainless steel
Microcentrifuge	–	–	Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000LAPTOP	–
Orbital shaker	–	–	Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 to 200 μL
PCR tube storage rack	Axygen	R96PCRFSP	–
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307608	0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304016	0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller	–	–	–
Red Blood Cells Lysis Buffer	Roche	11 814 389 001	For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge	–	–	Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container	–	–	–
Transfer pipette	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Sterile
Trypan Blue	Gibco	15250-061	0.4% Solution
Tube racks	–	–	For different tube sizes
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	–