Выделение жизнеспособных адипоцитов и стромально-васкулярной фракции из висцеральной жировой ткани человека, пригодных для анализа РНК и фенотипирования макрофагов

Summary

Данный протокол обеспечивает эффективный метод расщепления коллагеназы для выделения жизнеспособных адипоцитов и клеток стромально-васкулярной фракции-SVF из висцерального жира человека в рамках одного процесса, включая методологию получения высококачественной РНК из адипоцитов и фенотипирование SVF-макрофагов путем окрашивания нескольких мембраносвязанных маркеров для анализа методом проточной цитометрии.

Abstract

Висцеральная жировая ткань (VAT) — это активный метаболический орган, состоящий в основном из зрелых адипоцитов и клеток стромально-васкулярной фракции (SVF), которые выделяют различные биологически активные молекулы, контролирующие метаболические, гормональные и иммунные процессы; В настоящее время неясно, как эти процессы регулируются в жировой ткани. Поэтому разработка методов, оценивающих вклад каждой клеточной популяции в патофизиологию жировой ткани, имеет решающее значение. Этот протокол описывает этапы выделения и предоставляет необходимые рекомендации по устранению неполадок для эффективного выделения жизнеспособных зрелых адипоцитов и SVF из биопсии НДС человека в одном процессе с использованием метода ферментативного расщепления коллагеназы. Кроме того, протокол оптимизирован для идентификации субпопуляций макрофагов и выделения зрелой РНК адипоцитов для исследований экспрессии генов, что позволяет проводить исследования по анализу взаимодействия между этими клеточными популяциями. Вкратце, биопсии с НДС промывают, измельчают механическим способом и переваривают для получения одноклеточной суспензии. После центрифугирования зрелые адипоциты выделяют флотацией из гранулы SVF. Протокол экстракции РНК обеспечивает высокий выход общей РНК (включая микроРНК) из адипоцитов для последующего анализа экспрессии. Одновременно SVF-клетки используются для характеристики субпопуляций макрофагов (про- и противовоспалительный фенотип) с помощью анализа методом проточной цитометрии.

Introduction

Белая жировая ткань состоит не только из жировых клеток или адипоцитов, но и из фракции нежировых клеток, известной как стромально-васкулярная фракция (SVF), которая содержит гетерогенную клеточную популяцию, состоящую из макрофагов, других иммунных клеток, таких как регуляторные Т-клетки (Tregs), а также эозинофилов, преадипоцитов и фибробластов, окруженных сосудистой и соединительной тканью ^1,2. Жировая ткань (АТ) в настоящее время считается органом, который регулирует физиологические процессы, связанные с метаболизмом и воспалением, с помощью адипокинов, цитокинов и микроРНК, продуцируемых и высвобождаемых различными клетками в ткани, с аутокринным, паракринным и эндокринным эффектами ^3,4. У человека белая жировая ткань состоит из подкожной жировой клетчатки (САТ) и висцеральной жировой ткани (ВАТ) с важными анатомическими, молекулярными, клеточными и физиологическими различиями между ними ^2,5. САТ составляет до 80% АТ человека, в то время как АТ находится в брюшной полости, преимущественно в брыжейке и сальнике, будучи метаболически более активными⁶. Кроме того, НДС является эндокринным органом, выделяющим медиаторы, оказывающие существенное влияние на массу тела, чувствительность к инсулину, липидный обмен и воспаление. Следовательно, накопление НДС приводит к абдоминальному ожирению и связанным с ожирением заболеваниям, таким как диабет 2 типа, метаболический синдром, гипертония и риск сердечно-сосудистых заболеваний, что является лучшим предиктором смертности, связанной с ожирением 6,7,8,9.

В гомеостатических условиях адипоциты, макрофаги и другие иммунные клетки взаимодействуют для поддержания метаболизма НДС посредством секреции противовоспалительных медиаторов¹⁰. Однако чрезмерное увеличение НДС способствует рекрутированию активированных Т-клеток, NK-клеток и макрофагов. Фактически, при постном НДС соотношение макрофагов составляет 5%, в то время как при ожирении это соотношение возрастает до 50%, при этом поляризация макрофагов от противовоспалительного к провоспалительному фенотипу, генерирует хроническую воспалительную среду^10,11.

В результате пандемии ожирения появилось поразительное количество отчетов, посвященных различным темам исследований НДС, включая биологию адипоцитов, эпигенетику, воспаление, эндокринные свойства и новые области, такие как внеклеточные везикулы, среди прочего 8,10,12,13. Однако, несмотря на то, что среда НДС определяется перекрестными помехами между адипоцитами и резидентными или прибывающими макрофагами, большинство исследований были сосредоточены только на одной популяции клеток, и существует скудная информация о взаимодействии этих клеток в НДС и их патофизиологических последствиях^11,14. Кроме того, ценные исследования, посвященные взаимодействию адипоцитов и макрофагов при АТ, были проведены с использованием клеточных линий, в которых отсутствовали условия прайминга in vivo 11,14,15. Подходящая стратегия для анализа взаимодействия или конкретного вклада этих клеток в НДС требует выделения обоих типов клеток из одной и той же биопсии жира для проведения анализов in vitro, которые отражают как можно более схожие свойства in vivo, регулирующие метаболизм НДС.

Несмотря на то, что методы неферментативной диссоциации, основанные на механических силах для разрушения АТ, обеспечивают минимальные манипуляции, эти методы не могут быть использованы, если целью является изучение SVF-клеток, так как они имеют меньшую эффективность в восстановлении клеток и низкую жизнеспособность клеток по сравнению с ферментативными методами, а также требуется больший объем ткани^16,17. Ферментативное расщепление с использованием коллагеназы является щадящим методом, который обеспечивает адекватное переваривание белков коллагена и внеклеточного матрикса волокнистых тканей, таких как WAT¹⁸, и часто используется, когда трипсин неэффективен или повреждает¹⁹. Протокол содержит фундаментальные рекомендации по устранению неполадок для эффективного выделения жизнеспособных зрелых адипоцитов и SVF-клеток из биопсии человека с НДС в одном процессе с использованием метода ферментативного расщепления коллагеназы, предоставляя информацию для обеспечения высокого выхода (количество, чистота и целостность) общей РНК из зрелых адипоцитов, включая микроРНК, для последующих применений экспрессии. В то же время протокол оптимизирован для идентификации субпопуляций макрофагов из SVF-клеток путем окрашивания нескольких мембраносвязанных маркеров для дальнейшего анализа методом проточной цитометрии²⁰.

Protocol

Этот протокол был одобрен IRB Национального института перинатологии (212250-3210-21002-06-15). Участие было добровольным, и все зарегистрированные женщины подписали форму информированного согласия. 1. Забор висцеральной жировой ткани Получение биопсии с НДС путем частичной ом…

Representative Results

В этом протоколе описывается ферментативный метод с использованием расщепления коллагеназы с последующим дифференциальным центрифугированием для выделения в одном процессе жизнеспособных зрелых адипоцитов и SVF-клеток из биопсии НДС, полученной от здоровых беременных женщин после ч…

Discussion

НДС играет решающую роль в регуляции обмена веществ и воспалении. Растущий интерес к роли адипоцитов и иммунных клеток в хроническом воспалении, связанном с ожирением, привел к разработке различных методов разделения SVF и жировых клеток, присутствующих в АТ. Тем не менее, большинство ме…

Materials

0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes	Corning	CLS4101-50EA	Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-L-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-R-S	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip	Axygen	T-1000-B-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip	Axygen	T-200-Y-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	–
2101 Bioanalyzer PC	Agilent	G2953CA	2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube	Corning	352003	Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes	Corning	CLS430828-100EA	Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent	Zymo Research	R2050-1-200	TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	–
Agilent Small RNA Kit	Agilent	5067-1548	–
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody	BioLegend	325620	0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker	–	–	250 ml, non sterile
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station	Agilent	5065-9951	–
Collagenase type II	Gibco	17101-015	Powder
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Powder
Direct-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps	–	–	Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray	–	–	Stainless steel
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	–
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	–
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter	BD Biosciences	648282	–
FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA	–
Manual cell counter	–	–	–
Mayo dissecting scisors	–	–	Stainless steel
Microcentrifuge	–	–	Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000LAPTOP	–
Orbital shaker	–	–	Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 to 200 μL
PCR tube storage rack	Axygen	R96PCRFSP	–
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307608	0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304016	0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller	–	–	–
Red Blood Cells Lysis Buffer	Roche	11 814 389 001	For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge	–	–	Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container	–	–	–
Transfer pipette	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Sterile
Trypan Blue	Gibco	15250-061	0.4% Solution
Tube racks	–	–	For different tube sizes
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	–