SITUハイブリダイゼーションにおける免疫RNA-蛍光を用いたSARS-CoV-2の可視化
Summary
ここでは、その蛍光におけるRNA蛍光をその蛍光(RNA-FISH)と免疫蛍光と組み合わせて、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化する簡単な方法を説明する。このプロトコルは、単一細胞レベルでのSARS-CoV-2 RNA-宿主相互作用の分子特性の理解を深める可能性がある。
Abstract
この原稿は、ヒト気道上皮の細胞株および三次元(3D)培養における重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化するために、免疫蛍光と組み合わせたその場ハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)のプロトコルを提供する。この方法は、プローブの局在化によって開始されたHCRに依存することにより、ウイルスRNAの非常に特異的で敏感な視覚化を可能にする。スプリットイニシエータプローブは、蛍光標識増幅器によって信号を増幅するのに役立ち、共焦点顕微鏡ではごくわずかなバックグラウンド蛍光を生み出します。異なる蛍光色素を用いたラベリングアンプは、様々なターゲットの同時認識を促進します。これにより、組織における感染のマッピングが、単細胞レベルでのウイルス病因および複製をよりよく理解することを可能にする。この方法を免疫蛍光と結合すると、宿主エピゲノムの交わりや免疫応答経路を含む宿主とウイルスの相互作用についての理解を深めることができます。このプロトコルは、敏感で特定のHCR技術により、診断ツールとしても使用できます。また、この技術は、将来出現する可能性のある非コードRNAおよびRNAウイルスを含む任意のRNAの検出を可能にするために容易に改変される可能性があることを覚えておくことも重要です。
Introduction
SARS-CoV-2は、2019年末に出現した新しいヒトベタコロナウイルスであり、数ヶ月後に前例のないパンデミックを引き起こしました。ウイルスは科学に新しいため、その生物学の多くとその宿主細胞への影響は不明のままである。したがって、感染時のウイルス細胞および-組織トロピズムのマッピングは、その基本的な生物学的特徴および宿主への影響が理解されるべきである場合に重要である。生化学的、生物学的、物理的なアッセイを含むウイルス宿主相互作用を調べるためにいくつかの技術が使用されています。このときハイブリダイゼーションは、細胞または組織内の特定のDNAまたはRNA配列に局部的に局部化する、標識された相補DNA、RNA、または修飾核酸プローブを採用する一般的な方法である。
HCR1を介してシグナル対ノイズ比を増幅することで感度を高める改変を組み込んだ新しいRNA蛍光化法(RNA-FISH)が開発されました。HCRは単一細胞レベルでのRNAの局在の研究を可能にする。この方法は、特異性、感度、解像度が高いため、基礎科学研究だけでなく、診断などの応用プロジェクトにも有用です。最近、この方法の実現可能性は、完全に分化されたヒト気道上皮(HAE)培養2内の毛状細胞に局在するSARS-CoV-2 RNAを検出するための実証された。HAE培養は、「自然感染」微小環境3、4の文脈でウイルス感染を研究するために使用される最も先進的なツールの1つを構成する。
ヒトコロナウイルス(HCoV)に関するいくつかの報告は、SARS-CoV-2を含む、HCoV感染および病態生理学に関するエピジェネティック修飾の重要性を強調する[5]、例えば、アンジオテンシン変換酵素2(ACE-2)受容体をコードする遺伝子のメチル化パターン6、7。興味深いことに、質量分光法スクリーニングは、SARS-CoV-2プロテオーム8と相互作用するいくつかのエピジェネティック因子を同定した。より具体的には、非構造タンパク質5(NSP5)は、エピジェネティックレギュレータに結合し、ヒストンデアセチラーゼ2、および触媒的に不活性なNSP5(C145A)とtRNAメチルトランスレシナーゼ1(24)と相互作用する。さらに、NSP16メチルトランスファー酵素活性はメチルトランスファー酵素阻害剤、シネフンジン9によって遮断される。しかしながら、COVID-19におけるこれらのエピジェネティック因子の正確な役割は不明のままである。HCoVの複製は、感染した細胞の細胞質において起こり、エピジェネティック修飾10によって調節される炎症反応を引き起こす。
例えば、HCoV-229Eは核因子κBシグナル伝達を細かく調合し、特定の領域11におけるH3K36およびH4K5のアセチル化を増加させることによって宿主細胞クロマチン景観を深く再プログラムする。中東呼吸器症候群関連コロナウイルス感染は、H3K27me3のレベルを増加させ、特定のインターフェロン感受性遺伝子12のサブセットのプロモーター領域においてH3K4me3を枯渇させる。さらに、ウイルスRNAは、フラビウイルス13、レトロウイルス14、15、およびコロナウイルス16について実証されるように、細胞免疫応答を引き起こす。ウイルスRNA上のエピジェネティックマーカーは、ヒト免疫不全ウイルス-1RNA-17のm7Aメチル化に示されるように、細胞センサーによる認識に役割を果たす可能性がある。しかし、SARS-CoV-2 RNAが免疫応答に与える影響とエピジェネティックなマークは関係していますか?
ここでは、細胞株および3D組織の免疫蛍光分析(完全分化HAE)と組み合わせた最適化されたRNA-FISH法について説明した。FISHや免疫蛍光などの細胞学的方法は広く用いられているが、この新世代のHCRに基づくこの新世代のハイブリダイゼーション法は、ウイルス検出に使用されたことがない(最近の刊行物を除く)2。一般に、免疫染色およびFISHには以下のステップが必要です: プローブまたは抗体の浸透を可能にする透過性;細胞材料が固定され、保存される固定;抗体または核酸プローブが適用される検出。そして最後に、視覚化のためのサンプルの取り付け。
既存のプロトコルはこれらの一般的な機能を共有しますが、関連するパラメータに関しては著しく異なります。ここでは、HAE培養およびベロ細胞におけるSARS-CoV-2 RNAを検出するために最適化された、単純な、免疫RNA-FISHプロトコルが記載されている。この技術は、次のステップを含む: (1) パラホルムアルデヒドを有する細胞の固定;(2) 洗浄剤またはメタノール(MeOH)での透過性(3) グレード付きの一連のMeOHソリューション(HAE培養のみ)による水分補給(4) 検出(5) HCR技術を用いた増幅により、SARS-CoV-2 RNAを検出する。(6) 免疫染色;(7)共焦点顕微鏡下でのイメージング。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫RNA-FISHはRNAおよび細胞タンパク質の二重染色のための信頼できる方法である。ここでは、細胞株およびHAE培養におけるSARS-CoV-2 RNAおよび細胞タンパク質の検出を可能にする修飾免疫RNA-FISHプロトコルが記載されている。このプロトコルは、細胞単層または特定の組織を含む異なる細胞モデルでの使用に適応することができる。この方法は、適切なプローブローカリゼーションによって開始?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、SARS-CoV-2に関する研究のための科学高等教育省と国立科学センターからの助成金(K.P.とUMO-2018/30/E/NZ1/00874にUMO2017/27/B/NZ6/02488を付与)によって支援されました。
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
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