Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус
Summary
Здесь мы описываем простой метод, который сочетает в себе РНК флуоресценции на месте гибридизации (РНК-ФИШ) с иммунофторесценцией для визуализации тяжелой острой коронавируса респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) РНК. Этот протокол может повысить понимание молекулярных характеристик взаимодействий РНК-хозяина SARS-CoV-2 на одноклеточном уровне.
Abstract
Эта рукопись содержит протокол для на месте гибридизации цепной реакции (HCR) в сочетании с иммунофлюоресценцией для визуализации тяжелой острой коронавируса респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) РНК в клеточной линии и трехмерных (3D) культур эпителия дыхательных путей человека. Метод позволяет высокоспецифическую и чувствительную визуализацию вирусной РНК, опираясь на HCR, инициированный локализацией зонда. Сплит-инициатор зонды помогают усилить сигнал флуоресцентно помечены усилители, в результате чего незначительные фоновые флуоресценции в конфокальной микроскопии. Маркировка усилителей различными флуоресцентными красителями облегчает одновременное распознавание различных целей. Это, в свою очередь, позволяет картировать инфекцию в тканях, чтобы лучше понять вирусный патогенез и репликацию на одноклеточном уровне. Соединение этого метода с иммунофлуоресценцией может способствовать лучшему пониманию взаимодействий между принимающей вирусом, включая чередование эпигенома хозяина и путей иммунного ответа. Благодаря чувствительной и специфической технологии УВКБ этот протокол также может использоваться в качестве диагностического инструмента. Важно также помнить, что метод может быть легко изменен, чтобы позволить обнаружение любой РНК, в том числе некодирующих РНК и РНК вирусов, которые могут возникнуть в будущем.
Introduction
ТОРС-КоВ-2 — новый бетакоронавирус человека, возникший в конце 2019 года, вызвав беспрецедентную пандемию несколько месяцев спустя. Поскольку вирус является новым для науки, большая часть его биологии и его влияние на клетки-хозяина остаются неизвестными. Таким образом, картирование вирус-клеток и ткани тропизма во время инфекции имеет важное значение, если его основные биологические характеристики и его влияние на хозяина должны быть поняты. Для изучения взаимодействия вирусов и принимающих вирусов используется несколько методов, включая биохимические, биологические и физические анализы. На месте гибридизации является распространенным методом, который использует помечены дополнительные ДНК, РНК, или модифицированные зонды нуклеиновой кислоты, которые локализуются в конкретных последовательностей ДНК или РНК в клетке или ткани.
Разработан новый метод гибридизации РНК на месте (RNA-FISH), который включает в себя модификации для повышения чувствительности путем усиления соотношения сигнала к шуму черезHCR 1. HCR позволяет изучать локализацию РНК на уровне одноклеточных. Благодаря высокой специфичности, чувствительности и разрешению этот метод полезен не только для фундаментальных научных исследований, но и для аппликативных проектов, например, диагностики. Недавно была продемонстрирована осуществимость этого метода для обнаружения РНК SARS-CoV-2, локализованной на цилиированных клетках в полностью дифференцированных 3D эпителия дыхательных путей человека (HAE)культур 2. HaE культуры представляют собой один из самых передовых инструментов, используемых для изучения вирусной инфекции в контексте “естественной инфекции”микроокниронии 3,4.
В нескольких докладах о коронавирусах человека (HCoV), в том числе ОРВИ-КоВ-2, подчеркивается важность эпигенетических модификаций в отношении инфекции HCoV и патофизиологии (рассмотрена в 5,например, метилирование модели гена, кодирующей ангиотензин-конвертирующий фермент 2 (ACE-2)рецептор 6,7. Интересно, что масс-спектрометрический скрининг выявил несколько эпигенетических факторов, которые взаимодействуют с протеомом ТОРС-КоВ-28. В частности, неструктурный белок 5 (NSP5) связывается с эпигенетическим регулятором, дицетилазой 2 гистона 2, а каталитически неактивный NSP5 (C145A) взаимодействует с тРНК метилтрансферазой 1 (24). Кроме того, активность метилтрансферазы NSP16 блокируется ингибитором метилтрансферазы, синефунгином9. Однако точная роль этих эпигенетических факторов в COVID-19 остается неясной. Репликация HCoV происходит в цитоплазме инфицированной клетки, и вызывает воспалительные реакции, которые регулируются эпигенетических модификаций10.
Например, HCoV-229E тонко настраивает ядерный фактор-каппа B сигнализации и глубоко перепрограммирует ландшафт хозяина клеточного хроматина за счет увеличения ацетилирования H3K36 и H4K5 в некоторыхрегионах 11. Коронавирусная инфекция, связанная с ближневосточным респираторным синдромом, повышает уровень H3K27me3 и истощает H3K4me3 в промоутерской области подмножественно конкретных чувствительных к интерферонугенов 12. Кроме того, вирусная РНК вызывает иммунные реакции клеток, как попродемонстрированодля флавивирусов 13,ретровирусов 14,15икоронавирусов 16. Эпигенетические маркеры вирусной РНК могут играть определенную роль в распознавании клеточными датчиками, как показано на m7A метилировании вируса иммунодефицита человека-1РНК 17. Тем не менее, остаются вопросы: Каково влияние SARS-CoV-2 РНК на иммунный ответ, и эпигенетические знаки участие?
Здесь описан оптимизированный метод РНК-ФИШ в сочетании с иммунофлуоресценцией клеточной линии и 3D тканей (полностью дифференцированный HAE). Хотя цитологические методы, такие как FISH и иммунофлуоресценция, широко используются, этот метод гибридизации на месте нового поколения, основанный на HCR, никогда не использовался для обнаружения вирусов (за исключением недавнейпубликации) 2. В целом, иммуностай и FISH требуют следующих шагов: проницаемка для обеспечения проникновения зондов или антител; фиксация, при которой клеточный материал фиксируется и сохраняется; обнаружение, при котором применяются антитела или зонды нуклеиновой кислоты; и, наконец, монтаж образцов для визуализации.
Хотя существующие протоколы имеют общие характеристики, они заметно различаются по отношению к задействованным параметрам. Здесь был описан оптимизированный, простой, иммуно-РНК-FISH протокол для обнаружения SARS-CoV-2 РНК в культурах HAE и клетках Веро. Техника включает в себя следующие шаги: (1) фиксация клеток с параформальдегидом; (2) проницаемая с моющим средством или метанолом (MeOH); (3) регидратация через градуированные серии растворов MeOH (только культур HAE); (4) обнаружение; 5) усиление с использованием технологии УВК для обнаружения РНК ТОРС-КоВ-2; (6) иммуностимулятор; и (7) изображения под конфокальцентом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH является надежным методом двойного окрашивания РНК и клеточных белков. Здесь описан модифицированный иммуно-РНК-ФИШ протокол, который позволяет обнаруживать РНК ТОРС-КоВ-2 и клеточные белки в клеточных линиях и культурах HAE. Этот протокол может быть адаптирован для использова?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Министерством науки и высшего образования для исследований ПО ТОРС-КоВ-2, а также грантами Национального научного центра (гранты UMO2017/27/B/N’6/02488 К.П. и УМО-2018/30/E/N’1/00874 К.К.-П.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
