نظام تنقية البروتين عالي الإنتاجية اقتصادي ومتعدد الاستخدامات باستخدام محول لوحة متعدد الأعمدة
Summary
يسمح محول لوحة متعددة الأعمدة الأعمدة الكروماتوغرافية لتكون واجهة مع لوحات جمع متعددة الآبار لتقارب مواز أو تنقية تبادل الأيونات توفير طريقة تنقية البروتين عالية الإنتاجية اقتصادية. ويمكن استخدامه تحت الجاذبية أو فراغ تسفر عن كميات ملليغرام من البروتين عن طريق الأجهزة بأسعار معقولة.
Abstract
تنقية البروتين أمر حتمي لدراسة بنية البروتين ووظيفته وعادة ما يستخدم في تركيبة مع التقنيات الفيزيائية الحيوية. كما أنها عنصر رئيسي في تطوير علاجات جديدة. العصر المتطور من البروتيوميات الوظيفية يغذي الطلب على تنقية البروتين عالية الإنتاجية والتقنيات المحسنة لتسهيل ذلك. افترض أن محول لوحة الأعمدة المتعددة (MCPA) يمكنه ربط أعمدة لونية متعددة من راتنجات مختلفة بلوحات متعددة الآبار لتنقية متوازية. تقدم هذه الطريقة طريقة اقتصادية ومتعددة الاستخدامات لتنقية البروتين التي يمكن استخدامها تحت الجاذبية أو الفراغ ، مما ينافس سرعة النظام الآلي. يمكن استخدام MCPA لاسترداد غلة ملليغرام من البروتين عن طريق طريقة معقولة وفعالة من حيث الوقت لتوصيف وتحليل لاحقة. تم استخدام MCPA لتنقية تقارب عالي الإنتاجية من مجالات SH3. كما تم إثبات تبادل الأيونات عبر MCPA لتنقية البروتين بعد الكروماتوغرافيا تقارب Ni-NTA، مما يشير إلى كيفية هذا النظام يمكن تكييفها لأنواع تنقية أخرى. نظرا لإعداده مع أعمدة متعددة ، يمكن إجراء التخصيص الفردي للمعلمات في نفس التنقية ، غير قابل للتحقيق من خلال الأساليب الحالية المستندة إلى اللوحة.
Introduction
تقنيات تنقية البروتين لتحقيق كميات ملليغرام من البروتينات النقية أمر حتمي لتوصيفها وتحليلها، وخاصة بالنسبة للطرق الفيزيائية الحيوية مثل NMR. تنقية البروتين هو أيضا مركزية عبر مجالات أخرى من الدراسة مثل عمليات اكتشاف المخدرات ودراسات التفاعل البروتين البروتين; ومع ذلك، تحقيق مثل هذه الكميات من البروتين النقي يمكن أن تصبح عنق الزجاجة لهذه التقنيات1،2،3. الطريقة الرئيسية لتنقية البروتين هي الكروماتوغرافيا ، والتي تشمل مجموعة متنوعة من الطرق التي تعتمد على الخصائص الفردية للبروتينات وعلاماتها. في الكروماتوغرافيا تقارب، والبروتينات لديها بروتين إضافي أو الببتيد عزر الذي يعمل كعلامة التي لديها تقارب لركيزة معينة على راتنج الكروماتوغرافيا4. طريقة التقارب الأكثر شيوعا هي كروماتوغرافيا تقارب المعادن (IMAC) باستخدام البروتينات الموسومة به ، في حين أن طريقة شعبية أخرى هي كروماتوغرافيا تبادل الأيونات التي تفصل بين البروتينات على أساس شحنتها. لأعلى درجة من النقاء، يتم استخدام مزيج من الكروماتوغرافيا المتقاربة وتبادل الأيونات معا، وعادة ما يتطلب معدات مختبرية باهظة الثمن للحصول على إنتاجية عالية.
العصر المتطور من البروتيوميات الوظيفية يغذي الطلب على تقنيات عالية الإنتاجية لتنقية البروتينات ليس المفرد لتحليل محدد ولكن أعداد كبيرة من البروتينات في وقت واحد لتحليل شامل ودراسات الجينوم واسعة5. الكروماتوغرافيا تقارب معدنية معطلة (IMAC) هي واحدة من الأساليب الأكثر استخداما لتنقية البروتين عالية الإنتاجية6،7 بعد أنظمتها الآلية مكلفة وغير ميسورة للمختبرات الصغيرة8. وتستخدم البدائل القائمة على الصفائح المتاحة حاليا، والتي يمكن الحصول عليها، استخدام معدات مختبرية يمكن الوصول إليها، مثل الفراغ. على الرغم من أن هذه الأساليب ناجحة في تحسين سرعة تنقية، فإنه يمكن تحقيق فقط تنقية عالية الإنتاجية على نطاق أصغر، مما أسفر فقط البروتين في نطاق ميكروغرام. هذه القيود تعني أن ما قبل معبأة 96 لوحات مرشح البئر (على سبيل المثال، من جنرال الكتريك للرعاية الصحية المملوكة الآن من قبل Cytiva) لا يمكن استخدامها قبل التقنيات الفيزيائية الحيوية9. الكروماتوغرافيا الجاذبية هي الطريقة الأكثر كفاءة من حيث التكلفة لتنقية; ومع ذلك، إعداد أعمدة متعددة غير مريح ويمكن أن يكون عرضة للخطأ لبروتينات متعددة.
وقد تم تطوير محول لوحة متعددة الأعمدة (MCPA) وثبت لتشغيل بنجاح وسهولة موازية تقارب الأعمدة اللونية في وقت واحد لتنقية له الموسومة الخميرة SH3 المجالات10. يوفر MCPA طريقة تنقية عالية الإنتاجية فعالة من حيث التكلفة لا تعتمد على الأجهزة المكلفة. يمكن تصميمها مرنة تنقية بشكل فعال ملليغرام من البروتين عن طريق أعمدة لونية تقارب متعددة تحت الجاذبية أو فراغ متعددة. علاوة على ذلك، يمكن تعديل نوع الراتنج وحجمه ومعلمات أخرى لكل عمود فردي لتحسينه بشكل أسرع. توضح هذه الدراسة أن الكروماتوغرافيا التبادلية الأيونية من قبل MCPA يمكن استخدامها بالتزامن مع الكروماتوغرافيا التقاربية من قبل MCPA لتعزيز تنقية نطاق Abp1 SH3. بالإضافة إلى ذلك، يمكن فصل ما يصل إلى 24 بروتينا مختلفا بالتوازي باستخدام هذه الأساليب.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب قوي وبسيط للاستخدام لعلماء الكيمياء الحيوية البروتين عديم الخبرة نسبيا، ولكن هناك بعض الاعتبارات أن نأخذ في الاعتبار.
تحذير بشأن ملء لوحات التجميع
لوحة جمع 48 جيدا نفسها يحمل فقط 5 مل لكل بئر في حين أن كل 96 جيدا يحمل فقط 2 مل. هذا يحتاج إلى أن يو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل جائزة التطوير المؤسسي (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم المنحة P20GM103451 ومنحة بحثية داخلية من جامعة ليفربول.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
