Un sistema di purificazione delle proteine ad alta produttività economico e versatile che utilizza un adattatore a piastre multi-colonna
Summary
Un adattatore a piastre multi-colonna consente di interfacciare le colonne cromatografiche con piastre di raccolta multi-pozzo per l’affinità parallela o la purificazione dello scambio ionico fornendo un metodo economico di purificazione delle proteine ad alta produttività. Può essere utilizzato sotto gravità o sottovuoto producendo quantità di milligrammo di proteine tramite strumentazione conveniente.
Abstract
La purificazione proteica è imperativa per lo studio della struttura e della funzione proteica e di solito viene utilizzata in combinazione con tecniche biofisiche. È anche una componente chiave nello sviluppo di nuove terapie. L’era in evoluzione della proteomica funzionale sta alimentando la domanda di purificazione delle proteine ad alto contenuto di produzione e tecniche migliorate per facilitare questo. Si è ipotizzato che un adattatore a piastre multi colonna (MCPA) possa interfacciare più colonne cromatografiche di diverse resine con piastre multi-pozzo per la purificazione parallela. Questo metodo offre un metodo economico e versatile di purificazione proteica che può essere utilizzato sotto gravità o sottovuoto, rivaleggiando con la velocità di un sistema automatizzato. L’MCPA può essere utilizzato per recuperare le rese di milligrammo delle proteine con un metodo conveniente ed efficiente in termini di tempo per la successiva caratterizzazione e analisi. L’MCPA è stato utilizzato per la purificazione dell’affinità ad alta produttività dei domini SH3. Lo scambio ionico è stato dimostrato anche attraverso l’MCPA per purificare la cromatografia di affinità post proteina post Ni-NTA, indicando come questo sistema possa essere adattato ad altri tipi di purificazione. Grazie alla sua configurazione con più colonne, la personalizzazione individuale dei parametri può essere effettuata nella stessa purificazione, irraggiungibile dagli attuali metodi a base di piastre.
Introduction
Le tecniche di purificazione delle proteine per ottenere quantità di milligrammi di proteine purificate sono imperative per la loro caratterizzazione e analisi, specialmente per metodi biofisici come nmr. La purificazione delle proteine è centrale anche in altre aree di studio come i processi di scoperta di farmaci e gli studi di interazione proteina-proteina; tuttavia, il raggiungimento di tali quantità di proteine pure può diventare un collo di bottiglia per questetecniche 1,2,3. Il metodo principale per la purificazione delle proteine è la cromatografia, che include una varietà di metodi che si basano sulle caratteristiche individuali delle proteine e sui loro tag. Nella cromatografia di affinità, le proteine hanno un motivo proteico o peptidico aggiuntivo che funziona come un tag che ha un’affinità per un certo substrato sulla resina cromatografica4. Il metodo di affinità più comune è la cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC) usando proteine con tag His, mentre un altro metodo popolare è la cromatografia a scambio ionico che separa le proteine in base alla loro carica. Per la massima purezza, una combinazione di cromatografia di affinità e scambio ionico viene spesso utilizzata insieme, di solito richiedendo costose attrezzature da laboratorio per un’elevata produttività.
L’era in evoluzione della proteomica funzionale sta alimentando la domanda di tecniche ad alta produttività per purificare proteine non singolari per analisi specifiche ma un gran numero di proteine contemporaneamente per analisi complete e studi a livello genomico5. La cromatografia ad affinità metallica immobilizzata (IMAC) è uno dei metodi più utilizzati per la purificazione delle proteine ad alto contenutodi produttività 6,7 mai suoi sistemi automatizzati sono costosi e inaccessibili per i laboratori piùpiccoli 8. Le alternative più convenienti basate su lastre attualmente disponibili utilizzano l’uso di apparecchiature accessibili basate su laboratorio, come il vuoto. Sebbene questi metodi siano riusciti a migliorare la velocità di purificazione, possono ottenere solo una purificazione ad alta produttività su scala più piccola, producendo solo proteine nell’intervallo dei microgrammi. Queste limitazioni significano che le piastre di filtro precondizione da 96 pozzi (ad esempio, di GE Healthcare ora di proprietà di Cytiva) non possono essere utilizzate prima delle tecniche biofisiche9. La cromatografia a gravità è il metodo di purificazione più conveniente; tuttavia, l’impostazione di più colonne è scomoda e può essere soggetta a errori per più proteine.
Un adattatore a piastre multi colonna (MCPA) è stato sviluppato e dimostrato di eseguire con successo e convenientemente colonne di cromatografia di affinità parallela contemporaneamente per purificare i domini SH3 del lievito con tag His-tagged10. L’MCPA offre un metodo di purificazione ad alta produttività economico che non dipende da costose strumentazioni. Il suo design flessibile può purificare efficacemente milligrammi di proteine da più colonne cromatografiche di affinità sotto gravità o collettore sottovuoto. Inoltre, il tipo di resina, il volume e altri parametri possono essere regolati per ogni singola colonna per un’ottimizzazione più rapida. Questo studio dimostra che la cromatografia a scambio ionico da parte dell’MCPA può essere utilizzata in combinazione con la cromatografia di affinità dall’MCPA per migliorare la purificazione del dominio Abp1 SH3. Inoltre, fino a 24 proteine diverse possono essere separate in parallelo usando questi metodi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo è robusto e semplice da usare per biochimici delle proteine relativamente inesperti, tuttavia ci sono alcune considerazioni da tenere a mente.
Attenzione alle piastre di raccolta di riempimento eccessivo
La piastra di raccolta da 48 porcile stessa contiene solo 5 mL per pozzo, mentre ogni 96 po ‘contiene solo 2 mL. Questo deve essere tenuto a mente quando si aggiunge buffer ed esegue il campione attraverso la colonna in quanto vi è il ri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata da un Institutional Development Award (IDeA) del National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di sovvenzione P20GM103451 e una borsa di ricerca interna dell’Università di Liverpool.
Materials
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
- Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
- Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
- Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
- Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
- Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
- Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
- Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
- Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
- Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
- Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
- Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O’Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
- Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).
