Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado
Summary
Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.
Abstract
A mucosa intestinal é forrada por uma única camada de células epiteliais que forma uma barreira dinâmica que permite o transporte paracelular de nutrientes e água, evitando a passagem de bactérias luminais e substâncias exógenas. Uma violação dessa camada resulta em maior permeabilidade ao conteúdo luminal e recrutamento de células imunes, ambas marcas de estados patológicos no intestino, incluindo doença inflamatória intestinal (DII).
Os mecanismos que regulam a função da barreira epitelial e a migração transepitelial (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) são incompletamente compreendidos devido à falta de métodos experimentais in vivo que permitem análises quantitativas. Aqui, descrevemos um modelo experimental murino robusto que emprega um segmento intestinal exteriorizado de íleo ou cólon proximal. O laço intestinal exteriorizado (iLoop) é totalmente vascularizado e oferece vantagens fisiológicas sobre abordagens baseadas em câmara ex vivo comumente usadas para estudar permeabilidade e migração de PMN através de monocamadas de células epiteliais.
Demonstramos duas aplicações deste modelo em detalhes: (1) medição quantitativa da permeabilidade intestinal através da detecção de dextrans rotulados por fluorescência no soro após injeção intraluminal, (2) avaliação quantitativa do PMN migrado através do epitélio intestinal para o lúmen intestinal após introdução intraluminal de quimioattractants. Demonstramos viabilidade deste modelo e fornecemos resultados utilizando o iLoop em camundongos sem a proteína epitelial associada à junção JAM-A em comparação com os controles. O JAM-A tem sido mostrado para regular a função da barreira epitelial, bem como pmn TEpM durante respostas inflamatórias. Nossos resultados utilizando o iLoop confirmam estudos anteriores e destacam a importância do JAM-A na regulação da permeabilidade intestinal e do PMN TEpM in vivo durante a homeostase e doença.
O modelo iLoop fornece um método altamente padronizado para estudos in vivo reprodutíveis de homeostase intestinal e inflamação e aumentará significativamente a compreensão da função da barreira intestinal e inflamação mucosa em doenças como o DII.
Introduction
A mucosa intestinal abrange uma única camada de células epiteliais intestinais colunares (IECs), células imunes de lamina propria subjacentes e mucosa muscular. Além de seu papel na absorção de nutrientes, o epitélio intestinal é uma barreira física que protege o interior do corpo de bactérias luminais, patógenos e antígenos dietéticos. Além disso, IECs e células imunes lamina propria coordenam a resposta imune induzindo tolerância ou resposta, dependendo do contexto e estímulos. Foi relatado que o rompimento da barreira epitelial pode preceder o aparecimento de inflamação patológica da mucosa e contribuir para a doença inflamatória intestinal (DII) que abrange tanto a colite ulcerativa quanto a doença de Crohn1,2,3,4,5,6,7. Indivíduos com colite ulcerativa apresentam migração transepitetelial excessiva (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) formando abscessos cripticos, achado que tem sido associado à gravidade da doença8,9. Embora a função da barreira epitelial comprometida e as respostas imunes excessivas sejam marcas do DII, faltam ensaios in vivo experimentais para realizar avaliações quantitativas da permeabilidade intestinal e do recrutamento de células imunes na mucosa intestinal.
Os métodos mais comuns utilizados para estudar a permeabilidade epitelial intestinal e o PMN TEpM empregam abordagens ex vivo baseadas em câmaras usando monocamadas IEC cultivadas em pastilhas de membrana porosa semi-permeável10,11,12. A integridade da barreira epitelial é monitorada por medidas de resistência elétrica transeptelial (TEER) ou pelo flux paracelular do isothionato fluoresceína (FITC) rotulado de dextran de apical ao compartimento basal13,14,15. Da mesma forma, o PMN TEpM é tipicamente estudado em resposta a um quimioattractant que é adicionado na câmara inferior16. O PMN é colocado na câmara superior e após um período de incubação, o PMN que migrou para o compartimento basal são coletados e quantificados. Embora esses métodos sejam úteis, fáceis de executar e muito reprodutíveis, eles são obviamente abordagens reducionistas e não representam necessariamente um reflexo preciso das condições in vivo.
Em camundongos, um ensaio comum para estudar a permeabilidade paracelular intestinal é por gavage oral do FITC-dextran e posterior medição da aparência FITC-dextran no soro sanguíneo13,17. A desvantagem deste ensaio é que representa uma avaliação da integridade geral da barreira do trato gastrointestinal e não da das contribuições regionais intestinais. Além disso, o azul Evans é comumente usado para avaliar vazamento vascular in vivo18 e também tem sido empregado para avaliar a permeabilidade mucosa intestinal em camundongos e ratos19,20,21. A quantificação de Evans azul na mucosa intestinal requer extração de tecido empregando incubação em formamide durante a noite. Portanto, o mesmo tecido não pode ser usado para estudar permeabilidade epitelial intestinal e infiltração de neutrófilos.
Aqui destacamos um protocolo simples que reduz o número de animais necessários para coletar dados reprodutíveis sobre permeabilidade mucosa cólon e migração transepitelial leucócito in vivo. Recomendamos, portanto, o uso de fitc-dextrans que são facilmente detectáveis no soro sanguíneo sem comprometer a integridade das alças intestinais que podem ser colhidas para análise posterior. Note-se que as alças ligadas intestinais têm sido utilizadas em várias espécies (incluindo rato, rato, coelho, bezerro) para estudar infecção bacteriana (como Salmonella, Listeria monocytogenes e Escherichia coli)22,23,24,25, bem como permeabilidade intestinal26; no entanto, até onde sabemos, não há estudos que investiguem mecanismos de PMN TEpM em regiões específicas do intestino, como íleo ou cólon que estejam comumente envolvidos no IBD.
Aqui descrevemos o modelo de alça intestinal do camundongo (iLoop) que é um método in vivo microcirúrgico robusto e confiável que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado do íleo ou do cólon proximal. O modelo iLoop é fisiologicamente relevante e permite a avaliação da integridade da barreira intestinal e do PMN TEpM em camundongos vivos sob anestesia. Demonstramos duas aplicações: 1) quantificação dos níveis de soro de 4 kDa FITC-dextran após administração intraluminal no iLoop 2) quantificação de PMN transmigrado no lloop lúmen após injeção intraluminal do potente chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Além disso, utilizando o modelo iLoop com ratos ou ratos jam-a-nulosque abrigam perda seletiva de JAM-A em IECs(Villin-cre; Jam-a fl/fl) em comparação com os camundongos de controle, somos capazes de corroborar estudos anteriores que relataram uma grande contribuição para a proteína associada à junção apertada JAM-A à permeabilidade intestinal e transmigração de neutrófilos15,28,29,30,31.
O modelo iLoop é um método altamente funcional e fisiológico que pode ser usado para corroborar ensaios in vitro. Além disso, este é um modelo experimental versátil que permite o estudo de vários reagentes que podem ser injetados no lúmen de loop, incluindo quimiocinas, citocinas, patógenos bacterianos, toxinas, anticorpos e terapêuticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os mecanismos responsáveis pela desregulação da função da barreira intestinal e o recrutamento de células imunes em condições patológicas como o IBD são incompletamente compreendidos. Aqui, detalhamos um modelo robusto in vivo murine que emprega um segmento intestinal exteriorizado bem vascularizado de cólon ileum ou proximal e permite a avaliação da permeabilidade intestinal, estudos de migração de neutrófilos, bem como outras aplicações.
O iLoop é uma cirurgia de não recu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. Sven Flemming da Universidade de Wuerzburg por suas contribuições para o estabelecimento do modelo proximal de laço de cólon, Sean Watson pela gestão das colônias de ratos e Chithra K. Muraleedharan por ajudar na aquisição das fotos do modelo iLoop. Este trabalho foi apoiado pela German Research Foundation/DFG (BO 5776/2-1) para KB, R01DK079392, R01DK072564 e R01DK061379 para C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
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