Функциональная оценка кишечной проницаемости и трансэпителиальной миграции нейтрофилов у мышей с использованием стандартизированной модели кишечной петли

Summary

Дисрегулируемая функция кишечного эпителиального барьера и иммунные реакции являются отличительными признаками воспалительных заболеваний кишечника, которые остаются плохо изученными из-за отсутствия физиологических моделей. Здесь мы описываем модель кишечной петли мыши, которая использует хорошо васкуляризованный и экстериоризованный сегмент кишечника для изучения проницаемости слизистой оболочки и рекрутации лейкоцитов in vivo.

Abstract

Слизистая оболочка кишечника выстлена одним слоем эпителиальных клеток, который образует динамический барьер, позволяющий параклеточный транспорт питательных веществ и воды, одновременно предотвращая прохождение просветных бактерий и экзогенных веществ. Нарушение этого слоя приводит к увеличению проницаемости для просветного содержимого и рекрутирования иммунных клеток, которые являются отличительными признаками патологических состояний в кишечнике, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК).

Механизмы, регулирующие эпителиальную барьерную функцию и трансэпителиальную миграцию (TEpM) полиморфноядерных нейтрофилов (PMN), изучены не полностью из-за отсутствия экспериментальных методов in vivo, позволяющих проводить количественный анализ. Здесь мы описываем надежную экспериментальную модель мышечных животных, которая использует экстериоризованный кишечный сегмент подвздошной или проксимальной кишки. Экстериоризированная кишечная петля (iLoop) полностью васкуляризирована и предлагает физиологические преимущества по сравнению с подходами на основе камер ex vivo, обычно используемыми для изучения проницаемости и миграции PMN через монослои эпителиальных клеток.

Мы подробно демонстрируем два применения этой модели: (1) количественное измерение кишечной проницаемости путем обнаружения флуоресцентно меченого декстрана в сыворотке крови после внутрипросветной инъекции, (2) количественная оценка мигрировавших ПМН через эпителий кишечника в просвет кишечника после внутрипросветного введения хемоатрактантов. Мы демонстрируем осуществимость этой модели и предоставляем результаты с использованием iLoop у мышей, у которых отсутствует эпителиальный плотный соединительный связанный белок JAM-A по сравнению с контрольной частью. Было показано, что JAM-A регулирует функцию эпителиального барьера, а также PMN TEpM во время воспалительных реакций. Наши результаты с использованием iLoop подтверждают предыдущие исследования и подчеркивают важность JAM-A в регуляции кишечной проницаемости и PMN TEpM in vivo во время гомеостаза и заболевания.

Модель iLoop обеспечивает высоко стандартизированный метод воспроизводимых in vivo исследований кишечного гомеостаза и воспаления и значительно улучшит понимание кишечной барьерной функции и воспаления слизистой оболочки при таких заболеваниях, как ВЗК.

Introduction

Слизистая оболочка кишечника включает в себя один слой столбчатых эпителиальных клеток кишечника (IIC), лежащих в основе иммунных клеток lamina propria и слизистых мышц. Помимо своей роли в поглощении питательных веществ, эпителий кишечника является физическим барьером, который защищает внутреннюю часть организма от просветных комменсальных бактерий, патогенов и диетических антигенов. Кроме того, ИЭК и иммунные клетки lamina propria координируют иммунный ответ, вызывая либо толерантность, либо реакцию в зависимости от контекста и стимулов. Сообщалось, что нарушение эпителиального барьера может предшествовать возникновению патологического воспаления слизистой оболочки и способствовать воспалительным заболеваниям кишечника (ВЗК), охватывающим как язвенный^колит,так и болезнь Крона^{1,2,3,4,5,6,7.} Лица с язвенным колитом представляют чрезмерную трансэпителиальную миграцию (TEpM) полиморфноядерных нейтрофилов (PMN), образующих абсцессы крипты, что было связано с тяжестью заболевания^8,9. Хотя нарушенная эпителиальная барьерная функция и чрезмерные иммунные реакции являются отличительными признаками ВЗК, отсутствуют экспериментальные анализы in vivo для выполнения количественных оценок проницаемости кишечника и рекрутации иммунных клеток в слизистую оболочку кишечника.

Наиболее распространенные методы, используемые для исследования проницаемости эпителия кишечника и PMN TEpM, используют подходы на основе камер ex vivo с использованием монослоев МЭК, культивируемых на полупроницаемых пористых мембранных вставках^10,11,12. Целостность эпителиального барьера контролируется либо измерениями трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), либо параклеточного потока флуоресцеина изотиоцианата (FITC), меченого декстраном от апикального до базального компартмента^13,14,15. Аналогичным образом, PMN TEpM обычно изучается в ответ на хемоатрактант, который добавляют в нижнюю камеру^16. ПМН помещают в верхнюю камеру, и после инкубационного периода ПМН, которые мигрировали в базальный отсек, собирают и количественно оценивают. Хотя эти методы полезны, просты в исполнении и очень воспроизводимы, они, очевидно, являются редукционистскими подходами и не обязательно представляют собой точное отражение условий in vivo.

У мышей распространенным анализом для изучения кишечной параклеточной проницаемости является пероральный прием FITC-декстрана и последующее измерение появления FITC-декстрана в сыворотке крови^13,17. Недостатком этого анализа является то, что он представляет собой оценку общей барьерной целостности желудочно-кишечного тракта, а не регионального кишечного вклада. Кроме того, синий Эванс обычно используется для оценки сосудистой утечки in vivo^18, а также был использован для оценки проницаемости слизистой оболочки кишечника у мышей и крыс^19,20,21. Количественная оценка синего цвета Эванса в слизистой оболочке кишечника требует извлечения из ткани с использованием инкубации в формамиде в течение ночи. Поэтому одну и ту же ткань нельзя использовать для изучения проницаемости эпителия кишечника и нейтрофильной инфильтрации.

Здесь мы выделяем простой протокол, который уменьшает количество животных, необходимых для сбора воспроизводимых данных о проницаемости слизистой оболочки толстой кишки и трансэпителиальной миграции лейкоцитов in vivo. Поэтому мы рекомендуем использовать FITC-декстранс, которые легко обнаруживаются в сыворотке крови без ущерба для целостности кишечных петель, которые могут быть собраны для дальнейшего анализа. Следует отметить, что кишечные лигированные петли использовались у различных видов (включая мышь, крысу, кролика, теленка) для изучения бактериальной инфекции (такой как Salmonella, Listeria monocytogenes и Escherichia coli)^22,23,24,25, а также кишечной проницаемости^26; однако, насколько нам известно, нет исследований, изучающих механизмы PMN TEpM в определенных областях кишечника, таких как подвздошная кишка или толстая кишка, которые обычно участвуют в ВЗК.

Здесь мы описываем модель кишечной петли мыши (iLoop), которая является надежным и надежным микрохирургическим методом in vivo, который использует хорошо васкуляризованный и экстериоризованный кишечный сегмент подвздошной или проксимальной толстой кишки. Модель iLoop физиологически актуальна и позволяет оценить целостность кишечного барьера и PMN TEpM на живых мышах под наркозом. Мы демонстрируем два применения: 1) количественная оценка сывороточных уровней 4 кДа FITC-декстрана после внутрипросветного введения в iLoop 2) количественная оценка трансмигрированного PMN в просвете iLoop после внутрипросветного введения мощного хемоттрактанта Лейкотриена B₄ (LTB₄₎^27. Кроме того, использование модели iLoop с мышами Jam-a-null или мышами, переносимыми селективную потерю JAM-A на IIC(Villin-cre; Jam-a ^fl/fl) по сравнению с контрольными мышами, мы можем подтвердить предыдущие исследования, в которых сообщалось о значительном вкладе в плотное соединение-ассоциированный белок JAM-A в проницаемость кишечника и трансмиграцию нейтрофилов^{15,28,29,30,31.}

Модель iLoop является высокофункциональным и физиологическим методом, который может быть использован для подтверждения анализов in vitro. Кроме того, это универсальная экспериментальная модель, которая позволяет изучать различные реагенты, которые могут быть введены в просвет петли, включая хемокины, цитокины, бактериальные патогены, токсины, антитела и терапевтические средства.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами и политикой Национальных институтов здравоохранения и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Мичиганском университете. 1. Предоперационная подготовка</…

Representative Results

Схематическое представление моделей петли подвздошной кисти и pcLoop изображено на рисунке 1 и рисунке 2соответственно. Анатомические снимки отображают критические этапы процедуры, включая экстериоризацию кишечного сегмента(Фиг.1В и <…

Discussion

Механизмы, ответственные за дисрегуляцию кишечной барьерной функции и рекрутирование иммунных клеток в патологических условиях, таких как ВЗК, изучены не полностью. Здесь мы подробно описываем надежную модель мышениц in vivo, которая использует хорошо васкуляризованный экстериоризован…

Materials

Equipment and Material
BD Alcohol Swabs	BD	326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8"	BD	305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2"	BD	305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle	BD	309659
15ml Centrifuge Tube	Corning	14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate	FisherScientific	07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm	MilliporeSigma	CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile	FisherScientific	25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)	E-Z Systems	EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml	VWR	21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape	FisherScientific	15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)	FST	12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe)	FisherScientific	06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes	Thomas Scientific	c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)	Sarstedt	41.1501.105
Moria Fine Scissors	FST	14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh)	Falcon	352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant	Dechra	12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps)	FST	11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps)	FST	1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting	HenrySchein	SS694
Student Fine Forceps, Angled	FST	91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle	Millipore Sigma	Z248029
96 Well Cell Culture Plate	Corning	3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm	Instech	FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA	Lonza	51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer	BioWhittaker	10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution	Corning	21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)	BioLegend	127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)	ThermoFisher	12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads	Invitrogen	C36950
Dithiotreitol	FisherScientific	BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated	R&D Systems	511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000	Sigma	60842-46-8
Isoflurane	Halocarbon	12164-002-25
Leukotriene B4	Millipore Sigma	71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)	BD Pharmingen	557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)	BD Bioscience	553142
Recombinant Murine IFN-γ	Peprotech	315-05
Recombinant Murine TNF-α	Peprotech	315-01A