通过等密度梯度纯化对U937细胞进行细胞分级分离

Summary

该分级分离方案将使研究人员能够从哺乳动物细胞中分离细胞质、核、线粒体和膜蛋白。后两个亚细胞级分通过等密度梯度进一步纯化。

Abstract

该协议描述了使用洗涤剂，机械裂解和等密度梯度离心的组合从哺乳动物细胞中获得亚细胞蛋白级分的方法。该程序的主要优点是它不依赖于仅使用增溶去垢剂来获得亚细胞级分。这使得可以将质膜与细胞的其他膜结合细胞器分离。该程序将有助于使用可重复，可扩展和选择性的方法确定细胞中的蛋白质定位。该方法已成功用于从人单核细胞系U937中分离胞质蛋白、核蛋白、线粒体蛋白和质膜蛋白。尽管针对该细胞系进行了优化，但该过程可以作为其他细胞系亚细胞分离的合适起点。讨论了该程序的潜在陷阱以及如何避免它们，以及可能需要考虑其他细胞系的改变。

Introduction

亚细胞分级分离是通过多种方法裂解细胞并将其分离成其组成成分的过程。研究人员可以使用这种技术来确定哺乳动物细胞中的蛋白质定位或富集否则无法检测到的低丰度蛋白质。虽然目前存在亚细胞分离的方法，也可以购买商业试剂盒，但它们受到该程序试图克服的几个限制。大多数细胞分级分离方法^{完全基于洗涤}剂1，2^，依赖于使用含有越来越多的去垢剂的缓冲液来溶解不同的细胞成分。虽然这种方法快速方便，但它会导致不纯的馏分。这些旨在使研究人员能够轻松分离细胞的一种或两种成分，但还不够复杂，无法同时从样品中分离出多个亚细胞组分。仅依靠洗涤剂通常会导致膜封闭的细胞器和质膜被不加选择地溶解，从而使这些成分的分离变得困难。使用这些试剂盒的另一个复杂因素是研究人员无法针对特定应用对其进行更改/优化，因为大多数组件都是专有配方。最后，这些试剂盒可能非常昂贵，使用次数有限，因此对于较大样品来说不太理想。

尽管有不依赖去垢剂的线粒体分离试剂盒，但它们并非设计用于分离质膜，并且产生的样品量明显低于标准分离方案^3，4。虽然差速离心方法更耗时，但它们通常会产生不同的馏分，而仅使用基于洗涤剂的试剂盒无法获得¹。无需单独使用增溶去垢剂的分离还允许使用超速离心和等密度梯度进一步纯化，从而减少交叉污染。该分级分离方案展示了使用基于去垢剂和高速离心的方法的组合从U937单核细胞中分离亚细胞级分。该方法将有助于分离哺乳动物细胞的核、细胞质、线粒体和质膜成分，而馏分之间的污染最小。

Protocol

1. 制备缓冲液和试剂 准备磷酸酶和蛋白酶抑制剂的新鲜溶液。将 17.4 mg 苯甲磺酰氟 （PMSF） 加入 1 mL 100% 乙醇中以制备 100 mM 储备液。注意：处理PMSF时应穿戴防护设备，因为摄入或吸入以及接触皮肤或眼睛时是危险的。对眼睛和皮肤有腐蚀性。 根据制造商的说明，准备市售蛋白酶抑制剂混合物（100x）。 将 91.9 mg 原钒酸钠 （SOV） 加入 1 mL 去离子水中以制备 500 mM ?…

Representative Results

该过程的示意图流程图（图1）直观地总结了成功分级分离悬浮生长的U9375 细胞的步骤。从等密度梯度顶部以等体积（1 mL）收集的级分显示了线粒体和膜组分的纯化（图2）。利用针对VDAC（一种定位于线粒体外膜6的蛋白质）的抗体，表明线粒体部分迁移到25%和30%碘沙醇（v / v）部分（图2A）。使?…

Discussion

该方法是先前发表的亚细胞分级分离方法的修改版本，无需使用高速离心¹¹。这种改进的方法需要更专业的设备才能获得最佳结果，但更全面且可重复性一致。

由于无法分离线粒体和膜样品以分析坏死性凋亡期间的蛋白质定位，因此有必要开发初始方案¹²。尝试使用大多数市售试剂盒中发现的完全基于洗涤剂的方法，导致含有质膜和细胞中?…

Materials

Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661