Фракционирование клеток U937 методом изопикновой очистки градиента плотности
Summary
Этот протокол фракционирования позволит исследователям выделить цитоплазматические, ядерные, митохондриальные и мембранные белки из клеток млекопитающих. Последние две субклеточные фракции дополнительно очищаются с помощью изопикнового градиента плотности.
Abstract
Этот протокол описывает способ получения субклеточных белковых фракций из клеток млекопитающих с использованием комбинации детергентов, механического лизиса и центрифугирования градиента изопикновой плотности. Основным преимуществом этой процедуры является то, что она не полагается на исключительное использование солюбилизирующих моющих средств для получения субклеточных фракций. Это дает возможность отделить плазматическую мембрану от других мембранно-связанных органелл клетки. Эта процедура облегчит определение локализации белка в клетках воспроизводимым, масштабируемым и селективным методом. Этот метод был успешно использован для выделения цитозольных, ядерных, митохондриальных и плазматических мембранных белков из клеточной линии моноцитов человека U937. Хотя эта процедура оптимизирована для этой клеточной линии, она может служить подходящей отправной точкой для субклеточного фракционирования других клеточных линий. Обсуждаются потенциальные подводные камни процедуры и способы их избежания, а также изменения, которые, возможно, потребуется рассмотреть для других клеточных линий.
Introduction
Субклеточное фракционирование представляет собой процедуру, при которой клетки лизируются и разделяются на составляющие их компоненты с помощью нескольких методов. Этот метод может быть использован исследователями для определения локализации белка в клетках млекопитающих или для обогащения белков с низким содержанием, которые в противном случае не были бы обнаружены. Хотя методы субклеточного фракционирования в настоящее время существуют, как и коммерческие наборы, которые можно приобрести, они страдают от нескольких ограничений, которые эта процедура пытается преодолеть. Большинство методов фракционирования клеток основаны исключительно на моющих средствах 1,2, основанных на использовании буферов, содержащих все большее количество моющего средства для солюбилизации различных клеточных компонентов. Хотя этот метод быстрый и удобный, он приводит к нечистым фракциям. Они предназначены для того, чтобы позволить исследователям легко выделить один или два компонента клетки, но недостаточно сложны, чтобы выделить несколько субклеточных фракций из образца одновременно. Опора исключительно на моющие средства обычно приводит к тому, что мембранно-закрытые органеллы и плазматическая мембрана без разбора солюбилизируются, что затрудняет разделение этих компонентов. Дополнительным осложнением от использования этих наборов является неспособность исследователей изменять / оптимизировать их для конкретных применений, поскольку большинство компонентов являются запатентованными составами. Наконец, эти наборы могут быть непомерно дорогими, с ограничениями в количестве применений, которые делают их менее идеальными для больших образцов.
Несмотря на наличие наборов для выделения митохондрий, которые не полагаются на моющие средства, они не предназначены для изоляции плазматической мембраны и дают значительно меньшее количество образца, чем стандартные протоколы изоляции 3,4. Хотя методы дифференциального центрифугирования являются более трудоемкими, они часто приводят к образованию различных фракций, которые не могут быть получены с помощью наборов1 исключительно на основе моющих средств. Сепарация без исключительного использования солюбилизирующих моющих средств также позволяет проводить дальнейшую очистку с использованием ультрацентрифугирования и изопикнических градиентов плотности, что приводит к меньшему перекрестному загрязнению. Этот протокол фракционирования демонстрирует выделение субклеточных фракций из моноцитов U937 с использованием комбинации подходов на основе детергентов и высокоскоростного центрифугирования. Этот метод облегчит выделение ядерного, цитоплазматического, митохондриального и плазматического мембранных компонентов клетки млекопитающих с минимальным загрязнением между фракциями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данный способ является модифицированной версией ранее опубликованного подхода к субклеточному фракционированию без использования высокоскоростного центрифугирования11. Этот модифицированный метод требует более специализированного оборудования для достижения наилуч?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH R15-HL135675-01 и NIH 2 R15-HL135675-02 для T.J.L.
Materials
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
| refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
| S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
| Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
- McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
- McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
