曼迪布勒穆林模型中矫形牙齿运动期间 PDL 胶原蛋白纤维的 3D 成像
Summary
我们提出了在小鼠中产生正畸牙齿运动的方案，以及无需分割即可对牙周韧带胶原纤维和血管进行3D可视化的方法。
Abstract
正畸牙齿运动是一种复杂的生物过程，由于外力而改变软硬组织改造。为了了解这些复杂的改造过程，研究牙齿和牙周组织在其3D上下文中至关重要，因此尽量减少任何分割和组织人工制品。由于小老鼠体积小、代谢率高、遗传学和易处理性，它们经常用于发育和结构生物学以及生物力学。原则上，这也使他们成为牙科相关研究的优秀模型。然而，一个主要的障碍是它们的牙齿尺寸小，尤其是摩尔。本文旨在为产生正畸牙齿运动的逐步协议和小鼠手底摩尔牙周韧带纤维成分的三维成像提供两种方法。提出的第一种方法是基于微CT设置，使新鲜胶原蛋白组织具有相增强成像功能。第二种方法是使用乙基肉桂的骨清除方法，使成像通过骨骼无需分割，并保留内源性荧光。结合这种结算方法与记者鼠标像Flk1-Cre：TdTomato 提供了第一次这样的机会来映像 PDL 和肺骨中的 3D 血管。
Introduction
正畸牙齿运动 （OTM） 中的基本生物学过程是骨骼重塑。这种改造过程的触发因素归因于牙周韧带（PDL）结构的变化，如细胞外基质（ECM）应力、坏死以及血管破坏和形成1、2、3。其他可能的紫外骨重塑触发因素与骨细胞在骨骼中的力感应以及骨质疏松体本身的机械变形有关：然而，他们在OTM中的角色仍然没有完全阐明4，5。
尽管许多研究旨在揭示在OTM期间PDL的结构-功能关系，一个明确的功能机制尚未定义6，7。其主要原因是在检索位于两个硬组织（水泥和肺骨）之间的软组织 （PDL） 的数据方面面临挑战。收集结构信息的公认方法通常需要固定和分割，从而破坏和修改 PDL 结构。此外，这些方法大多产生二元数据，即使没有失真，也只提供部分和本地化的信息。由于 PDL 的结构和功能不均匀，因此有必要采用一种处理整个齿-PDL-骨骼复合体完整 3D 结构的方法。
本文将描述在小鼠中生成 OTM 的方法和两种在不分割样品的情况下实现 PDL 中胶原纤维的 3D 可视化的方法。
Murine 模型广泛应用于医学、发育生物学、药物输送和结构研究中的活体实验。它们可以进行基因改造，以消除或增强特定的蛋白质和功能：它们提供快速、可重复和可预测的发展控制;它们也很容易图像，因为他们的小尺寸8。尽管它们有许多优点，但牙科研究中的鼠标模型并不经常使用，尤其是在需要临床操作时，这主要是因为牙齿尺寸小。动物模型，如老鼠9，10，11，狗12，13，猪14，15，16和猴子17比老鼠使用更多。随着高分辨率成像技术的不断发展，利用鼠标模型破译OTM中错综复杂的过程的优点是多种多方面的。本文提出了一种方法，以产生摩尔牙在可塑性与恒定力水平，触发骨重塑的中微运动。大多数在啮齿动物中的OTM实验是在最大值进行的，因为可操纵性和舌头的存在增加了另一个复杂程度。但是，当需要 3D 结构完整性时，可强制具有许多优势。它可以很容易地解剖为整个骨头：在某些物种中，它可以通过纤维共生被分成两个下摆：它是紧凑的，平坦的，只包含没有任何鼻窦空间的牙齿。相比之下，最大骨是头骨的一部分，与其他器官和结构密切相关，因此需要进行广泛的分割，以便用相关的牙齿解剖杏骨。
我们利用室内湿度室与高分辨率微CT内部的加载系统相结合，实现相位增强，开发出一种3D中可视化新鲜纤维组织的方法，如先前描述的9、18、19、20、21、22、23。动物牺牲后立即扫描新鲜组织，无需任何污渍或固定，从而减少组织人工制品以及生物力学特性的改变。这些3D数据可用于分布和方向分析的纤维，如其他地方描述19。
这里介绍的第二个 3D 全组织成像方法基于可拆解的光学清除，使 PDL 纤维在无需任何分割的情况下通过骨骼成像。有趣的是，它也使骨骼本身的胶原纤维可视化，但这里不会讨论这个问题。一般来说，组织清除有两种方法。第一种是水基清除，样品浸入水溶液中，通过简单的浸入、高水化或水凝胶嵌入，折射指数大于 1.4。然而，这种方法在透明度和组织结构保存方面是有限的，因此需要固定组织。第二种方法，产生高度透明的样品，不需要固定是溶剂为基础的清除方法24，25。我们为曼迪布拉样品生成了基于乙基-3-苯丙-2-苯酸酯（乙基肉碱，ECi）的改性溶剂清除方法。该方法具有使用无毒食品级清除剂、最小组织收缩和荧光蛋白保存等优点。
Protocol
所有动物实验均符合国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》和哈佛大学机构动物护理与使用委员会的准则（第01840号议定书）。 1. 矫形牙齿运动 要生成鼠标床，请使用带楔形、45° 角头的扁平塑料平台。头靠面可以通过切割塑料盒生成。 提升平台的头部端，在头架和桌面平面之间产生大约 30° 角。将弯曲的厚回形针（直径为 0.036″）连接到头部侧端，以?…
Representative Results
本文提出了一种生产OTM的方法，以及两种在PDL内对胶原纤维进行三维成像的方法，无需任何分割。出于动物研究目的，当牙齿不对齐时，如果牙齿运动在所有根部产生对腹膜骨的重塑，则被视为正畸运动。为了生成可靠的 OTM，需要在牙齿上施加恒定的力水平。在这里，激活的形状记忆 NiTi 线圈用于在 7 天及以后的实验时间内产生 10 克的一致力（如果有必要）。此处描述的线圈激活 （<strong class="x…
Discussion
由于大小、遗传学和处理优势，在小鼠体内产生OTM是非常理想的。使用可手性在组织解剖以及样品制备和成像方面都提供了一个易于处理的操作。在这里，我们介绍了一种在OTM后7天内产生OTM的方法，即牙齿在骨骼内的转化运动。使用此协议，可以延长牙齿运动的整个持续时间，因为激活的线圈为运动提供了高达 1 mm 的恒定力水平。然而，线圈的中微侧固定在切口上，切口不断喷发。因此，力向量…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了国家卫生研究院（NIDCR R00-DE025053，PI：Naveh）的支持。我们要感谢哈佛生物成像中心的基础设施和支持。所有数字均以 biorender.com 生成。
Materials
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
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Cite This Article
Xu, H., Lee, A., Sun, L., Naveh, G. R. S. 3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model. J. Vis. Exp. (170), e62149, doi:10.3791/62149 (2021).